1、ICS 67120X 04 a亘中华人民共和国国家标准GBT 213102007动物源性食品中甲状腺拮抗剂残留量检测方法 高效液相色谱串联质谱法Determination of residues of thyreostats in foodstuffs of animal OriginHPLC-MSMS method20071 029发布 200804-01实施宰瞀嬲紫瓣訾糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会仅111前 言GBT 21310-2007本标准的附录A、附录B、附录c均为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准起草
2、单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：彭涛、于静、国伟、李晓娟、孙利、凌云、代汉慧、张鸿伟、储晓刚、唐英章。动物源性食品中甲状腺拮抗剂残留量检测方法 高效液相色谱串联质谱法GBT 2131020071范围本标准规定了动物源性食品中硫脲嘧啶(2一thiouracil，TU)、甲巯咪唑(methimazole，TAP)、甲基硫氧嘧啶(methyl thiouracil，MTU)、丙硫氧嘧啶(propyl thiouracil，PTU)、苯基硫氧嘧啶(phenyl thiouracil，PhTU)、2-巯基苯并咪唑(2一mercaptobenzimida
3、zole，MBI)残留量高效液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于动物源性食品肌肉(兔肉、鸡肉、牛肉、猪肉)、内脏(兔肝、鸡肝)、奶和蛋中硫脲嘧啶、甲巯咪唑、甲基硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、苯基硫氧嘧啶、2巯基苯并咪唑残留量的定性确证和定量测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neq ISO
4、3696：1987)3方法提要采用乙酸乙酯提取试样中残留的硫脲嘧啶、甲巯咪唑、甲基硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、苯基硫氧嘧啶和2-巯基苯并咪唑，提取液经液液分配和HLB固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱串联质谱定性检测，内标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41 甲醇：高效液相色谱级。42甲酸：高效液相色谱级。43乙酸乙酯：高效液相色谱级。44正己烷：高效液相色谱级。45乙腈：高效液相色谱级。46磷酸。47巯基乙醇。48二水乙二胺四乙酸二钠。49无水硫酸钠：650(2灼烧4 h，置于干燥器中备用。410 01 m01L乙二胺四乙酸二钠溶液：准确称取
5、372 g二水乙二胺四乙酸二钠(48)，用水溶解并定容至1 L。411乙腈饱和的正己烷：量取正己烷80 mL于100 mL分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层。412 01甲酸水溶液：准确量取1 mL甲酸(42)，用水定容至1 L。413 0002 5 molL磷酸：准确量取02 mL磷酸，用水定容至1 L。1GBT 213102007414溶解液：90 mL 01甲酸水溶液(412)中加入10 mL甲醇。415标准物质：硫脲嘧啶、甲巯咪唑、甲基硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、苯基硫氧嘧啶、2一巯基苯并咪唑，纯度均99。416内标物质：5，6-二甲基硫氧嘧啶(5，6-dimet
6、hyl-2一thiouracil，DMTU)，纯度99。417标准储备溶液：准确称取适量标准品(精确至0000 1 g)，用甲醇溶解，配制成浓度为100-gmL的标准储备溶液，一18冷冻避光保存，有效期3个月。418混合中间标准溶液：准确移取标准储备液(417)各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为10-gmL的混合中间标准溶液，4冷藏避光保存，有效期1个月。419混合标准工作溶液：根据需要用甲醇把混合中间标准溶液(418)稀释成适合浓度的混合标准工作溶液，现用现配。420内标标准储备液：准确称取适量5，6-二甲基硫氧嘧啶(精确至0000 1 g)，用甲醇溶解，配制成浓
7、度为100 pgmL的内标标准储备溶液，一18冷冻避光保存，有效期3个月。421内标标准工作溶液：准确移取01 mL内标标准储备液(420)于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1 pgmL的内标标准工作溶液，CC冷藏避光保存，有效期1个月。422 HLB固相萃取柱：200 mg，6 mL，或相当者。423微孔滤膜：020,am，有机相。424氮气：纯度99999。425氩气：纯度99999。5仪器和设备51液相色谱串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。52组织捣碎机。53分析天平：感量0000 1 g，0Ol g。54均质器：10 000 rmin。55振荡器。56离心机：lO
8、 000 rmin。57氮吹仪。58旋涡混合器。59超声波水浴。510减压浓缩仪。511梨形瓶：100 mL。512具塞塑料离心管：50 mL。513刻度试管：10 mL。5，14移液枪：5 mL，1 mL，200 pL。515分液漏斗：50 mL。6试样制备61肌肉和内脏从原始样品取出有代表性样品约500 g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于一18冷冻避光保存。62奶从原始样品取出有代表性样品约500 g，充分搅拌混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4冷藏避光保存。2GBT 21310200763
9、蛋从原始样品取出有代表性样品约500 g，去壳后用组织捣碎机搅拌充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4冷藏避光保存。注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化。7样品处理71提取称取约5 g试样(精确至001 g)于50 mL塑料离心管中，依次加入150 pL内标标准工作液(421)、50 pL巯基乙醇(47)、30 PL 01moLL的乙二胺四乙酸二钠溶液(410)和适量无水硫酸钠(49)，吸去样品中的水分，再加入20 mL乙酸乙酯，用均质器以10 000 rrain均质1 min后，振荡提取20 min，再以4 000 rrain离心
10、5 rain，收集上清液于100 mL梨形瓶中。残渣用20 mL乙酸乙酯再提取一次，合并上清液，在40水浴中减压浓缩至近干。残留物用10 mL乙腈溶解，并转移至50 mL分液漏斗中，用30mL乙腈饱和后的正己烷(411)分三次液液分配，去除油脂。收集乙腈层，在40水浴中减压浓缩至近干，残留物用10 mL 0002 5 molL磷酸(413)溶解，超声波水浴助溶5 min后，待净化。72净化HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水预淋洗后，转入10 mL样品提取液(71)。先用5 mL水进行淋洗，弃去；再用5 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中。整个固相萃取净化过程控制流速
11、不超过2 mLmin。洗脱液在40下用N。吹干。残留物用1 mL溶解液(414)溶解，涡动1 min后，过02*m微孔滤膜，供仪器检测。73混合基质标准溶液的制备称取5份约5 g阴性试样(精确至001 g)于50 mL塑料离心管中，按照标准曲线最终定容浓度分别加入混合中问标准溶液(418)或混合标准工作溶液(419)，再加入150 pL内标标准工作液(421)，余下操作同71和72。8测定81液相色谱条件a) 色谱柱：Waters ACQUITY uPLc“BEH C1B 50 mmX21 ram(内径)，17 pm，或相当者b)柱温：30；c)流速：02 mLmin；d)进样量：5 pL；e
12、) 流动相及洗脱条件见表1。衰1流动相及梯度洗脱条件时间rain 流动相A(甲醇) 流动相B(412)O 10 90100 10 90400 90 10600 90 10700 10 901000 10 9082串联质谱条件参见附录A。GBT 21310200783液相色谱串联质谱测定831定性测定按照上述条件测定样品和混合基质标准溶液，如果样品的质量色谱峰保留时间与混合基质标准溶液一致；定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。混合基质标准溶液的液相色谱串联质谱色谱图参见图B1。表2定性测定时相对离子丰度的最
13、大允许偏差相对离子丰度 50 2050 1020 10允许的相对偏差 士2CI 士25 土30 土50832定量测定按照内标法进行定量计算。84空白试验除不称取试样外，均按照以上步骤进行。9结果计算按式(1)进行计算：v RfXV“一1万=式中：x试样中分析物的含量，单位为微克每千克(Lgkg)；R样液中的分析物与内标物峰面积比值；c混合基质标准溶液中分析物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)y样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；R。混合基质标准溶液中的分析物与内标物峰面积比值；m试样的质量，单位为克(g)。注：计算结果需将空白值扣除。10测定低限(LOQ)本方法的测定低限为：硫脲嘧啶、甲巯
14、咪唑50Lgkg；甲基硫氧嘧啶、2一巯基苯并咪唑30 btgkg；丙硫氧嘧啶、苯基硫氧嘧啶5Lgkg。11 回收率和精密度参见表C1。附录A(资料性附录)串联质谱条件毛细管电压：3O kV；源温度：120；去溶剂温度：350；锥孔气流：氮气，流速50 Lh；去溶剂气流：氮气，流速600 Lh；碰撞气：氩气，碰撞气压26010 Pa；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)，监测条件见表A1。表A1多反应监测条件GBT 213102007驻留时间 锥孔电压 碰撞能量化合物母离子(mz) 子离子(mz)V eV甲巯眯唑 57 01 30 15115(TAP) 88 01 30 15硫脲
15、嘧啶 112 01 30 13129(TU) 70 01 30 15甲基硫氧嘧啶 84。 01 30 15143(MTU) 126 O1 30 152巯基苯并眯唑 9r 01 35 201 51(MBI) 65 01 35 255，6二甲基硫氧嘧啶157 140 01 30 15(DMTU)(内标)丙硫氧嘧啶 154 01 30 15171(PTU) 112 01 30 18苯基硫氧嘧啶 103 01 30 23205(PhTU) 188 01 30 154用于定量。1)所列参数是在Waters Quattro Premier质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业
16、目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。5GBT 2131020076附录B(资料性附录)标准样品质量色谱图_ ” 128,91121絮L，而r弱F蕊F品F_丽一11L一。2i；，：，蕊，；?；：，；j；i，ij；i，ji；，i：，；，二97。鼍L一”媚 138 “26”36oLT丽Ui丽ii了ii万晶r_磊r嚆 ”8 一sxzsso王1丽上1丽焉r巾蕊Fi丽召万i，1乳一一一，嵯一一一一一一一，=8丑一一一一一鹾一一一一一一一：_翌一一一一一(一一一一一一一二_，一，一世，一一一一一，一二”PhTU100 2 300 400 500 6 00 7001轧一一一一一一止二一一一一一二
17、二注：按保留时间先后依次为：硫脲嘧啶、甲琉咪唑、甲基硫氧嘧啶56二甲基硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、2一巯基苯并咪唑和苯基硫氧嘧啶。图B1 甲状腺拮抗剂标准样品质量色谱图眦。量墨。附录C(资料性附录)添加回收率表c1 8种动物源性食品中甲状腺拮抗剂添加回收率(n=10)GBT 213102007添加浓度 平均测定值 回收率范围 相对标准偏差食品名称 化合物QLgkg) (#gkg) 50 498 9691058 35TU 100 1027 9871089 47200 2098 99o1078 5350 509 9891058 27TAP 100 987 9081015 93200 1916 92O98
18、9 3230 311 9891045 41MTU 100 978 9071019 35200 1928 8821094 94鸡肉30 283 922993 38MBI 100 1052 9821086 48200 1927 9391009 395 42 813891 45PTU 50 515 9741082 58100 1022 9471088 485 45 882955 61PhTU 50 491 9571052 57100 989 9701054 3350 503 9791038 29TU 100 977 9271029 45200 1927 9101078 6850 489 939102
19、8 47TAP 100 1012 9481075 74200 2016 95O1089 39兔肉30 279 8891045 62MTU 100 987 9071019 58200 1989 9721017 4830 323 10021093 47MBI 100 1012 9721036 43200 1997 9391059 617GBT 213102007表C1(续)添加浓度 平均测定值 回收率范围 相对标准偏差食品名称 化合物(,ugkg) (pgkg) 5 51 9821091 69PTU 50 495 9121065 93100 1022 10071068 22兔肉5 48 87299
20、5 67PhTU 50 489 9531032 56100 1029 9901054 3450 487 9291038 61TU 100 1022 9871042 35200 1988 9101027 4750 519 9591068 37TAP 100 982 9381025 51200 2106 956-1039 4830 289 939995 3ZMTU 100 1056 9671089 47200 2077 9821097 23猪肉30 317 10021094 51MBI 100 986 9521016 41200 1987 9491053 395 48 9321031 41PTU
21、50 489 9421062 48100 1029 10171058 335 53 9821095 39PhTU 50 489 9531012 47100 1037 97O1084 6350 513 9691058 57TU 100 985 9271022 41200 1902 920987 5750 479 919985 25牛肉 TAP 100 973 9471027 52200 2059 9571089 4730 312 9191089 88MTU 100 986 9661031 31200 2022 9821097 378表C1(续)GBT 213102007添加浓度 平均测定值 回收
22、率范围 相对标准偏差食品名称 化合物(Pgkg) (pgkg) 30 311 lOO21084 47MBI loo 975 9521016 28200 1984 9491032 525 47 932991 37牛肉 PTU 50 512 9421062 44100 1072 10171098 465 52 9821095 34PhTU 50 517 9531092 27100 1034 97o1087 4850 478 9291038 55TU 100 1007 9271022 35200 1938 91o987 4450 485 9591068 38TAP 100 982 938-1025
23、72200 1988 9571089 4630 322 10091095 32MTU 100 1056 9661089 45200 2055 9821097 34兔肝30 315 10021084 68MBI 100 967 9521016 29200 1987 9491032 455 47 932991 33PTU 50 488 9421062 25100 1034 10171098 475 53 9821095 33PhTU 50 532 9531092 25100 1027 97o1074 5750 484 9291038 35TU 100 996 987102Z 36200 2015
24、91o1087 67鸡肝50 518 9591068 45TAP lOO 959 9381025 45200 1996 9561089 979(；BT 213102007表C1(续)添加浓度 平均测定值 回收率范围 相对标准偏差食品名称 化合物(,“gkg) (pgkg) 30 268 829995 55MTU 100 1042 9661089 37200 2124 9521084 8830 313 10021084 53MBI 100 976 9521016 57200 2032 9491032 39鸡肝5 5】 9521071 43PTU 50 477 9381065 35100 967
25、95o998 675 43 832995 48PhTU 50 483 9551035 49100 1028 9691057 5150 518 9841054 28TU lOO 988 9461015 43200 193，4 920998 6850 488 9691058 44TAP 100 1037 9871089 51200 2092 99o1078 3830 288 922983 42MTU 100 1042 9821088 55200 1928 9321002 27牛奶30 295 9661035 48MBI loo 959 90710l，9 32200 1927 9321094 685
26、 44 861943 69PTU 5Q 496 9571059 61loo 988 97O1046 2，25 53 9021081 66PhTU 50 519 9741082 76100 1048 101_71088 33lo表c1(续)GBT 213102007添加浓度 平均测定值 回收率范围 相对标准偏差食品名称 化合物(pgkg) (,ugkg) 50 502 9591058 39TU 100 979 9471049 42200 2017 9781078 3350 487 938998 55TAP lOO 1035 9431062 61200 2056 97o1088 4930 307 9871044 45MTU lOO 985 9171059 49200 2003 9721038 33鸡蛋30 318 lOO21093 43MBI 100 1032 9621066 77200 1994 9391047 295 53 9821091 37PTU 50 475 9Z81065 78100 987 95o1028 295 45 872995 57PhTU 50 497 9551035 45Ioo 1025 9691058 32
