1、GB 1309391 本标准参照采用国际标准ISO 48331978食品和动物饲料中微生物学检验方法。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中细菌总数的测定方法。 本标准适用于饲料中细菌总数的测定。 2 原理 将试样稀释至适当浓度，用特定的培养基，在301下培养723h，计数平板中长出的菌落数，计算每克试样中的细菌数量。 3 仪器、设备 3.1 天平：感量为0.1g。 3.2 振荡器：往复式。 3.3 干热灭菌箱：502001。 3.4 高压灭菌锅。 3.5 冰箱：普通冰箱。 3.6 恒温箱：301。 3.7 电炉：可调式。 3.8 平皿：直径为9cm。 3.9 吸管：容量为1、10mL。
2、 3.10 三角烧瓶：容量为250、500mL。 3.11 玻璃珠。 3.12 试管：18180mm。 3.13 水浴锅：461。 3.14 酒精灯。 3.15 试管架。 3.16 橡皮乳头。 4 检验程序 细菌总数的检验程序如下： 页码，1/4GB 13093912006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbkK130930A.htm 5 操作步骤 5.1 采样 采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处
3、。 根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品混合。 海运进口饲料采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛饲料超过10 000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。 5.2 试样稀释及培养 5.2.1 无菌称取试样10.0g，放入含有90mL稀释液的灭菌三角烧瓶内（瓶内预先加有适当数量的玻璃珠）。经充分振摇，制110的均匀稀释液。最好置振荡器中以8 00010 000rmin的速度处理23min。 5.2.2
4、 用1mL灭菌吸管吸取110稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，作成1100的稀释液。 5.2.3 另取一支1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支吸管。 5.2.4 根据饲料卫生标准要求或对试样污染程度的估计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 页码，2/4GB 13093912006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbkK130930A.htm5.2.5 稀释液
5、移入平皿后，应及时将凉至461的平板计数用培养基（可放置461水浴锅内保温）注入平皿约15mL，小心转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过15min。 如估计到试样中所含微生物可能在琼脂平板表面生长时，待琼脂完全凝固后，可在培养基表面倾注凉至461的水琼脂培养基4mL。 5.2.6 待琼脂凝固后，倒置平皿于301恒温箱内培养723h取出，计数平板内菌落数目，菌落数乘以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。 5.3 菌落计数方法 作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时借助于放大镜检查，以防遗漏。在计数出各平板菌落数后，求出同一稀释度两个平板菌落的平均数。 6 菌落
6、计数的报告 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数，如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全平板菌落数。 6.1 稀释度的选择 6.1.1 应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。 6.1.2 如有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，视两者之比如何来决定，如其比值小于2，应报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数字。 6.1.3 如所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀
7、释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 6.1.4 如所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 6.1.5 如所有稀释度均无菌落生长，则以小于（）1乘以最低稀释倍数报告之。 6.1.6 如所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 6.2 结果报告 菌落在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。 附 录 A 稀释液和培养基制备 （补充件） 除特殊规
8、定外，本标准所用化学试剂为分析纯；生物制剂为细菌培养用；水为蒸馏水或页码，3/4GB 13093912006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbkK130930A.htm无离子水。要求在试验条件下，所用试剂应无抑制细菌生长的物质存在。 A1 稀释液 A1.1 成分 A1.2 制法 将上述成分加热溶解，校正pH使其在灭菌后保持7.02。按9mL支分装于试管，90mL瓶分装于三角烧瓶中，塞上棉塞包扎后1211高压灭菌20min 。 A2 平板计数用培养基 A2.1 成分 A2.2 制法 将上述成分加热溶化，校正pH使其在灭菌后保持7.02。过滤、分装三角烧瓶中，包扎后1211高压灭菌20min。 A3 水琼脂培养基 A3.1 成分 A3.2 制法 加热使琼脂溶化，校正pH使其在灭菌后保持7.02。分装三角烧瓶中，包扎后1211高压灭菌20min。 上述稀释液和培养基如不马上使用，应保持在05下，时间不超过一个月。 氯化钠（GB 1266） 8.5g蛋白胨 1.0g蒸馏水 1000mL蛋白胨 5.0g酵母浸膏 2.5g无水D-葡萄糖 1.0g琼脂 918g蒸馏水 1000mL琼脂 918g蒸馏水 1000mL页码，4/4GB 13093912006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbkK130930A.htm
