1、中华人民共和国国家标准水质急性毒性的测定发光细菌法发布实施国家环境保护局发布中华人民共和国国家标准水质急性毒性的测定发光细菌法国家环境保护局批准实施主题内容与适用范围主题内容本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法适用范围本标准适用于工业废水纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测方法提要基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度以此表示其急性毒性水平水质急性毒性水平按所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度以为单位来表征或选用值半数有效浓度以样品液百分浓度为单位来表征试剂和材料本标准所用试剂除另有说明外均应为符合国家标准的分
2、析纯试剂蒸馏水或同等纯度的水氯化汞氯化钠化学纯明亮发光杆菌小种冻干粉安瓿瓶包装每瓶在冰箱内有效保存期为个月新制备的发光细菌休眠细胞冻干粉密度不低于每克万个细胞当按步骤将冻干粉复苏后即发光可在暗室内检验肉眼应见微光稀释成工作液后每毫升菌液不低于万个细胞测试管或万个细胞测试管均为稀释平板法测定在毒性测试仪上测出的初始发光量应在之间低于允许将倍率调至档高于允许将倍率调至档仍达不到标准者更换冻干粉氯化钠溶液氯化钠于玻璃容器内用量筒加蒸馏水氯化钠溶液氯化钠加蒸馏水于试剂瓶内保存参比毒物氯化汞标准溶液氯化汞母液万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞入容量瓶用氯化钠溶液稀释至刻度置冰箱备用保存期个
3、月氯化汞工作液用移液管吸氯化汞母液入容量瓶用氯化钠溶液定容再用移液管吸取氯化汞液入容量瓶用氯化钠溶液定容将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶然后用氯化钠溶液将氯化汞溶液按表稀释成系列浓度一律采用容量瓶这些氯化汞稀释液保存期不超过超过者务必重配表氯化汞工作溶液稀释配制系列在容量瓶中加氯化汞数稀释定容后氯化汞浓度仪器生物发光光度计配置或测试管当氯化汞标准溶液浓度为时发光细菌的相对发光度为其误差不超过或测试样品管具标准磨口塞为制造比色管的玻璃料制作由专业玻璃仪器厂制造分别适用于相应型号的生物发光光度计微量注射器注射器定量加液瓶吸管试剂瓶量筒棕色容量瓶半微量滴定管配磨口试液瓶全套仪器均为棕色样品样品的采
4、集和保存采样瓶使用带有聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶务必清洁干燥采集水样时瓶内应充满水样不留空气采样后用塑胶带将瓶口密封毒性测定应在采样后内进行否则应在下保存样品但不得超过报告中应写明水样采集时间和测定时间对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除以免干扰测定样品液的稀释样品液测定前稀释的条件样品液预试验取事先加氯化钠至浓度的样品母液装入样品管并设一支管氯化钠溶液按所述测定相对发光度按测得的样品相对发光度低于乃至零欲以表达结果则须稀释按测得的样品相对发光度在以上欲以与相对发光度相当的氯化汞浓度表达结果则不须稀释样品液的稀释液样品液的稀释液一律用蒸馏水在定容前一律按构成氯化钠浓度添加氯化钠或浓溶液母液只能加
5、固体样品液稀释浓度的选择探测试验按对数系列将样品液稀释成个浓度它们的对数依次为按所述粗测一遍视相对发光度落在哪一浓度范围试验在相对发光度所落在的浓度范围内再增配个浓度例如若落在之间则应稀释成若落在之间则应稀释成按所述再测一遍这个浓度也可通过查对数表按等对数间距原则自行确定例如若落在之间则应稀释成它们的对数相应为对数间距均为测定测定条件室温室温同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过且所有测试器皿及试剂溶液测前均置于控温的测试室内若须测定包括影响在内的急性毒性不应调节水样若须测定排除影响在内的急性毒性须将水样和氯化钠测前调至下值主要含水样为主要含其他金属水样为主要含有机化合物水样为溶解氧本法只能
6、测定包括溶解氧影响在内的急性毒性测定步骤试管的排列于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管按所述样品母液相对发光度为以上者如下排列左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管右侧放样品管前排放氯化汞溶液和样品管后一排放对照管后二排放预试验管每管氯化汞或样品液均配一管氯化钠蒸馏水溶液设次重复每测一批样品均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液表试管在试管架上的排列后二排预试预试后一排前排样样样样样样样管群氯化汞样品按所述样品母液相对发光度为以下乃至零者如下排列左侧仅放氯化汞溶液管作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度它反应的相对发光度应在左右右侧放样品稀释液管从低浓度到高浓度依次排列其他同每测一批样
7、品均须同时配测氯化汞溶液加氯化钠溶液用的定量加液瓶给每支管加或氯化钠据仪器型号而定加样品液用或吸管给每支样品管加或样品液据而定每个样品号换一支吸管发光细菌冻干菌剂复苏从冰箱室取出含有发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液投入置有冰块的小号保温瓶用注射器吸取冷的氯化钠适用于测试管或冷的氯化钠适用于测试管注入已开口的冻干粉安瓿瓶务必充分混匀后菌即复苏发光可在暗室内检验肉眼应见微光备用仪器的预热和调零打开生物发光光度计电源预热调零备用仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量另取一空或测试管加或氯化钠据而定加复苏发光菌液盖上瓶塞用手颠倒次以达均匀拔去瓶塞将该管放入各自型号仪器测试舱内若发光量立即显示或经过上升到以上
8、此瓶冻干粉可用于测试低于者按处理菌液发光量先缓慢上升约持续后缓慢下降约持续满的发光量应不低于低于者更换冻干粉给各测试管加复苏菌液在发光菌液复苏稳定约半小时后按所述从左到右按氯化汞或样品管前管后氯化汞或样品管前管后顺序用微量注射器勿用定量加液器以减少误差准确吸取复苏菌液逐一加入各管盖上瓶塞用手颠倒次拔去瓶塞放回原位每管加菌液间隔时间勿短于每管在加菌液的当时务必精确计时记录到秒即为样品与发光菌反应起始时间立即将此时间加记作各管反应终止也即应该读发光量的时间发光细菌与样品反应达到终止时间的读数按各管原来加菌液的先后顺序当某管达到记录的反应终止时间在不加瓶塞的情况下立即将测试管放入仪器测试舱读出其发光
9、量以光信号转化的电信号电压数表示有色样品测定干扰的校正拿掉仪器样品舱上的黑色塑料管口取一测试管直径加氯化钠溶液将该管放进一装有少量氯化钠溶液的管直径内要使外管与内管的氯化钠液面平齐此作管另取一测试管加氯化钠溶液放入另一装有少量有色待测样品液的管内要使外管与内管的氯化钠液面平齐此作管于和二管的内管中同时加复苏发光菌液注意必须是本批样品测定所用同一瓶复苏菌液立即记时到秒等反应满迅即放入仪器测试舱测定二只带有内管的测试管的发光量分别记下发光量管和管计算因颜色引起的发光量校正值按和所述常规步骤测试带色样品管及其管氯化钠溶液的发光量所有管测得之发光量均须减去校正值后才能作为发光量图有色样品溶液测定干扰的
10、校正测试结果的表达计算样品相对发光度并算出平均值相对发光度氯化汞管或样品管发光量管发光量相对发光度平均值重复重复重复符合条件者建立并检验氯化汞浓度与其相对发光度均值的相关方程也可以绘制关系曲线求出一元一次线性回归方程的截距斜率回归系数和相关系数列出方程氯化汞查相关系数显著水平值表检验所求值的显著水平若且氯化汞则所求相关方程成立反之不能成立须重测系列氯化汞浓度的发光量氯化汞溶液配制过夜者须重配后再测定也可以据建立的上述方程绘制关系曲线即指定发光度为和代入上式求出相应的二个氯化汞浓度在常数坐标纸上定出二点画一直线即为符合该方程的氯化汞浓度与相对发光度的关系曲线符合条件者建立并检验样品稀释浓度与其相
11、对发光度均值的相关方程绘制关系曲线按所述方法建立相关方程样并检验相关系数显著水平值若则所求相关方程成立反之不能成立须重测样品稀释系列浓度的发光量根据测试结果表达样品急性毒性用氯化汞浓度表达样品毒性适用的条件符合条件样品母液相对发光度大于并按建立了合格氯化汞的氯化汞浓度与其相对发光度相关方程者表达方法将测得的样品相对发光度代入的相关方程求出与样品急性毒性相当的氯化汞浓度一般用表示测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的氯化汞浓度值适用性适用于相对发光度在以上特别是以上即不可能出现值但低于即仍有中低水平毒性的样品毒性测定用值表达样品毒性适用的条件符合条件样品母液相对发光度低于乃至零并按建立了合
12、格的样品稀释液浓度与其相对发光度相关方程者表达方法将代入建立的相关方程求出样品的值这里的值以样品的稀释浓度一般用百分浓度表示测试结果报告列举样品的值适用性适用于相对发光度在以下特别是零即毒性水平较高或很高的样品毒性测定后者无法以相当的氯化汞浓度表达毒性测定记录格式见表表样品急性毒性发光细菌测定法实验记录测定日期测定人提取方式分析号加菌液时间反应开始读到秒测定时间反应分钟读到秒发光量相对发光度样品均值抑制发光率备注回归方程测定结果报告内容实验室室温采样地点日期时间氯化汞浓度或样品稀释百分浓度与相对发光度的相关方程氯化汞样品值稀释百分浓度或相对发光度及其相当的氯化汞浓度测定人及所在单位方法的精密度样品次重复测定结果的相对偏差应不大于附加说明本标准由国家环境保护局科技标准司提出本标准由中国科学院南京土壤研究所负责起草本标准起草人顾宗濂谢思琴周德智乔鸿泽本标准委托中国环境监测总站负责解释
