1、ICS 11. 020 C 05 量国中华人民共和国国家标准GB/T 26348-2010 蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酷胆碱酶酶法Test methods of mosquito resistance to insecticides 一-Test methods of insensitive acetylcholinesterase for the mosquito 2011-01-14发布2011-05-01实施数码防伪中华人民共和国卫生部电士中国国家标准化管理委员会。叩中华人民共和国国家标准蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酷胆暗自旨酶法GB/T 26348- 2010 争号中国标准出版社出版发行
2、北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销4峰开本880X12301/16 印张0.5字数8千字2011年4月第一版2011年4月第一次印刷祷t;号:155066. 1-42179定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目。吕本标准按照GB/T1. 1 2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。GB/T 26348-2010 本标准起草单位:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国农业大学、北京市疾病预防控
3、制中心。本标准主要起草人:赵彤言、汪中明、李春晓、董言德、高希武、曾晓声t、佟颖。I 1 范围蚊虫抗药性检测方法不敏感乙酷胆碱醋酶法本标准规定了蚊虫体内不敏感的乙酷胆碱醋酶(AChE)的检测方法。GB/T 26348-2010 本标准适用于谈色库蚊(Cu.l口抖抖enspallens)、致倦库蚊CCx.ipiensqui叫uefsciat)、白纹伊蚊(AedesalboPictus)、中华按蚊(Anophelessinensis)等对有机磷类、氨基甲酸醋类杀虫剂抗性的生物化学检测。2 术语和定义2. 1 下列术语和定义适用于本文件乙酷胆础酶区分f:t.度discriminaing concen
4、raton of ace1yIcholinesterase 能够抑制敏感蚊虫乙酷胆碱酣酶生理活性90%的杀虫药剂的浓度。3 试虫现场多点采集幼虫，室内饲养，采用羽化日3dJ5 d未吸血!Eff歧进行检测，冰浴条件下储存不超过 d，一200C条件下储存不超过1间或80 oc条件F储存6个月以内。4 试剂4. 1 磷酸氢二铀CNazHP(4) ，分析纯。4.2 磷酸二氢饵(KHzP04)，分析纯。4.3 曲拉通X-OO(Trton X-00)。4.4 乙m硫代胆碱(ATCh)，分析纯。4.5 5，5人二硫双硝基苯甲酸(DTNB)，分析纯。4.6 磷酸缓冲液(0.moI/L , pH7. 5 PB曰
5、:称取30.8 g Naz HP04 12Hz 0和2.16g KHzP04蒸馆水定容至1000 mL。4.7 DTNB-乙醇显色剂:12.4 mg DTNB，加120mL 95%乙醇，80mL蒸馆水，50mL磷酸盐缓冲液(pH7. 5 ,0.1 mol/L，含0.1%Triton X-100)。4.8 ATCh溶液:称取28.9mg ATCh溶于10mL蒸馆水中，一200C避光保存。4. 9 A TCh-DTNB混合溶液=称取75mg ATCh和13mg DTNB，用100mL磷酸盐缓冲液溶解。5 分光光度法5. 1 仪器设备5. 1. 1 分光光度计。1 GB/T 26348-2010 5
6、. 1. 2 恒温水浴箱。5.1.3 1 mL玻璃组织匀浆器。5.1.4 离心机(离心力10000g以上)。5. 1. 5 加液器。5.2 操作步骤5.2. 1 酶源的制备取成蚊5只做为1组，放入4.C预冷的玻璃组织匀浆器中，加入0.5mL磷酸盐缓冲液(pH7.5 ,0.1 mol/L，含0.1%Triton X-100)，充分匀浆。匀浆液在4.C , 5 OOOg离心5min，取上清液作为待测酶液，冰浴保存备用。5.2.2 取6支试管，分别加入6.1.1中制备酶液0.1mL，在其中3支试管中分别加入0.1mL的杀虫剂溶液，充分混匀，使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酷胆碱醋酶的区
7、分浓度参见附录A表A.1)，且丙酣终浓度小于1%。另3支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为元药剂对照管;再取l支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液，作为空白对照。5.2.3 上述7支试管30.C保、温5min后，分别加入O.1 mL O. 01 mol/L乙酷硫代胆碱(ATCh)，在30 .C继续保温15min后，加入3.6mL DTNB-乙醇显色剂。5.2.4 将空白对照调至仪器显示为0点，在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值(OD412)，计算平均值。5.2.5 按上述方法每个种群检测100组蚊虫。5. 3 结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(1):
8、门nE=二三x 100% . ( 1 ) ODc 式中:E 一-AChE残存活性;ODt 药剂处理管平均光密度值OD412;ODc 元药剂对照管平均光密度值OD412。5.4 判别标准AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的蚊虫组为对有机磷或氨基甲酸醋类药剂抗性组，抗性组在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。6 酶标仪法6. 1 仪器设备6. 1. 1 酶标仪。6.1.2 恒温水浴箱。6. 1. 3 1 mL玻璃组织匀浆器。6.1.4 离心机(离心力10000g以上)。6. 1.5 加液器。GB/T 26348-2010 6.2 操作步骤6.2. 1 酶源的制备取
9、成蚊1只，放入4oC预冷的玻璃组织匀浆器中，加入0.5mL 4 oC预冷的磷酸盐缓冲液充分匀浆。匀浆液在4oC , 5 OOOg离心5min，取上清液作为待测酶液，冰浴保存备用。6.2.2 分取0.1mL 6.2.1中制备酶液到酶标板的3个孔中，再在各孔中加入0.1mL杀虫剂溶液，杀虫剂用磷酸缓冲液稀释，使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酷胆碱醋酶的区分浓度参见表A.1)，且丙酣的终浓度不超过1%。以0.1mL磷酸盐缓冲液作为元药剂对照，加入另外3个孔中。在300C保温5min后，分别加入0.2mL ATCh-DTNB混合溶液，在412nm测定5min时间动力学曲线，曲线的斜率作为
10、反应初速度(吵。计算平均值。6.2.3 按上述方法每个种群检测100只蚊虫。6.3 结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(2): 式中:E -AChE残存活性;百:一药剂处理组平均反应初速度;E=旦x100% U 王一无药剂对照组平均反应初速度。6. 4 判别标准.( 2 ) AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的蚊虫为对有机磷或氨基甲酸醋类药剂抗性个体，抗性个体在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。OFONi寸SNH由。GB/T 26348-2010 附录(资料性附录)常用杀虫剂对淡色库蚊乙酷胆喊醋酶的区分政度A 表A.l给出了残杀威和敌敌畏对淡色库蚊乙酷胆碱醋酶的区分浓度。常用杀虫剂对谈色库蚊乙酷胆喊醋酶的区分浓度杀虫剂区分浓度g/L 残杀威Cpropoxur)0.011 5 敌敌畏CDDVP)0.081 3 注:敏感品系来自军事医学科学院微生物流行病研究所蚊虫养殖室淡色库蚊北京株。表.l侵权必究书号:155066 1-42179 定价:争6版权专有14.00 7G GB/T 26348-2010 打印H期:2011年5月4日F002A
