1、ICS 11. 020 C 05 道雪中华人民共和国国家标准GB/T 26349-2010 蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酷胆碱醋酶法Test methods of fly resistance to insecticides一Test methods of insensitive acetylcholinesterase for musca domestica 2011-01-14发布数码防伪中华人民共和国卫生部也士中国国家标准化管理委员会QC.l IJ 2011-05-01实施中华人民共和国国家标准蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酷胆畸菌蔼法GR/T 26349 2010 当k中国标准出版社
2、出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:1 00045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销当&开本880X 1230 1/16 印张0.5字数9千字2011年4月第一版2011年4月第一次印刷句俗书号:155066 1-42180定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目。吕本标准按照GB/T1. 1一2009给出的起草规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。G/T 26349-2010 本标准起草单位:中国农业大学、北京市疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科
3、学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人:高希武、曾晓荒、梁沛、马彦、刘婷、佟颖、赵彤言。I GB/T 26349-2010 蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酷胆碱醋酶法1 范围本标准规定了家蝇(Muscadomestica)不敏感乙眈胆碱醋酵(AChE)的检测方法。本标准适用于家蝇对有机磷、氨基甲酸醋类药剂抗药性的生物化学检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 Z酷胆耐醋酶区分浓度discriminating concel山ati()nof acetylcholin四terase能够抑制敏感品系家蝇乙耽胆碱醋酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度，单位为moJjL或mmol/Lo
4、2.2 Fl代Flgeneration 从现场捕捉的家蝇，繁殖后得到的第-代。3 试虫现场采集家蝇，室内饲养，习习化J3 d5 d的FlftJllitt!:家蝇。冰浴条件下储存不超过1d , 一200C条件下储存不超过1周或-80 oC条件下储存6个月以内。4 试剂4. 1 磷酸氢二铀(Na2HP04)，化学纯。4.2 磷酸二氢伺(KH2P04)，化学纯。4.3 曲拉通X-IOO(Triton X-IOO)。4.4 乙酷硫代胆碱(ATCh)，分析纯。4.5 5，5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)，分析纯。4.6 磷酸缓冲液(0.1mol/L , pH7. 5 PB曰:称取30.18g Na2 H
5、P04 12H20和2.16g KH2P04，蒸锢水定容至1000mL。4.7 DTNB-乙醇显色剂:称取12.4mg DTNB，溶于125mL 95%乙醇中，加入50mL磷酸缓冲液，最后用蒸馆水定容至250mL, 4 .C避光保存。4.8 ATCh溶液z称取28.9mg ATCh溶于10mL蒸馆水中，一20.C避光保存。5 分光光度法5. 1 仪器设备5. 1. 1 分光光度计。1 GB/T 26349-2010 5. 1. 2 恒温水浴箱。5. 1. 3 玻璃组织匀浆器。5. 1. 4 台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。5. 1. 5 加液器。5.2 杀虫药剂的配制用丙酣或其他的有
6、机溶剂将杀虫药剂配制成母液，试验前用磷酸盐缓冲液(含O.1 % Triton X 100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酷胆碱醋酶的区分浓度见表A.l)的2倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。5.3 操作步骤5.3.1 取家蝇1只，用眼科剪刀或手术刀片将头部剪(切)下，放入4oc预冷的政璃组织匀浆器(1mL) 中，加入0.5mL 4 oc预冷的磷酸盐缓冲液(含O.1 % Triton X-100) ，充分匀浆。5.3.2 匀浆液在4oC , 10 000 g离心15min，取上清液即为酶液，冰浴保存备用。5.3.3 取4支试管，分别加入上述酶液0.1mL，在其中3支试管中分
7、别加入一定量的杀虫药剂溶液O.lmL，使其终浓度达到区分剂量，第4支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲破，作为空白对照。5.3.4 上述5支试管30oC保温5min后，分别加入0.1mL ATCh，在300C继续保温15min后，加入1. 6 mL DTNB乙醇显色剂。5.3.5 以空白对照调仪器0点，在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值(OD412)。5.3.6 按上述方法每个种群检测100只家蝇。5.4 结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(1): 式中:E -AChE残存活性;OD卢川E=二x100
8、% ODc OD，一一药剂处理管平均光密度值OD412;ODc二元药剂对照管平均光密度值OD412o5.5 判别标准. ( 1 ) AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸醋类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。6 酶标仪法6. 1 仪器设备6. 1. 1 酶标仪。6.1.2 恒温水浴箱。6. 1.3 玻璃组织匀浆器。6. 1. 4 台式冷冻离心机(离心力10000 g以上)。6. 1. 5 加液器。6.2 杀虫药剂的配制GB/T 26349-2010 用丙酣或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，试验前用磷酸盐缓冲
9、液(含o.1% Triton X-100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酷胆碱醋酶的区分浓度见附录A表A.2)的2. 5倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。6.3 操作步骤6.3. 1 取家蝇1只，用眼科剪刀或于术刀片将头部剪下，放入4.C预冷的玻璃组织匀浆器(1mL)中，加入0.5mL 4. .C预冷的磷酸盐缓冲液(含O.1 % Triton X-100) ，充分匀浆。6.3.2 匀浆液在4.C , 10000 g离心15min，取上清液即为酶液，冰浴保存备用。6.3.3 在酶标板孔中加入0.1mL酶液，在每个孔中分别加入0.05mL DTNB和0.1mL含抑制剂的ATC
10、h溶液，抑制剂终浓度为区分浓度，每只家蝇设元抑制剂对照一个，用缓冲液代替抑制剂量，在酶标仪中读数5min，曲线的斜率作为反应初速度(吵。计算平均值。6.3.4 按上述方法每个种群检测100只家蝇。6.4 结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(2):式中:E -AChE残存活性;V , 药剂处理组平均反应初速度;吼一无药剂对照组平均反应初速度。6.5 要11到标准E=生x100% U . ( 2 ) AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸醋类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。OFON-寸的NH闰。GB/T 2
11、6349-2010 附录(资料性附录)常见杀虫药剂对敏感家蝇晶系乙酷胆耐醋酶的区分浓度A 表A.l给出了用分光光度法测出的3种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酷胆碱醋酶的区分浓度。A.1 3种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酷胆破醋酶的区分法度(分光光度法)区分浓度190杀虫药剂mol/L 敌敌畏CDDVP)2 X 10-5 残杀威(propoxur)4X 10- 灭多威(methomyl)6X 10-5 注:敏感品系来自中国农业大学选育的家蝇敏感品系，2004年测定结果。表A.1表A.2给出了用酶标仪法测出的3种杀虫剂对敏感家蝇品系乙m胆碱醋酶的区分浓度。A.2 3种杀虫药剂对敏感家蝇晶系Z酷胆喊醋酶的区分浓度(酶标仪法)杀虫药剂区分浓度190mol/L 敌敌畏(DDVP)3 X 10-3 残杀威(propox时5 X 10-4 灭多威(methomyl)4 X 10-2 注:敏感品系来自中国农业大学选育的家蝇敏感品系，2004年测定结果。表A.2侵权必究书号:155066 1-42180 定价:唔版权专有14.00 )G GB/T 26349一2010打印日期:2011年5月4fI F002A
