1、中华人民共和国卫生行业标准全血胆碱自旨酶活性的分光光度测定方法硫代乙酷胆碱-联硫代双硝基苯甲酸法Blood-Determination of cholinesterase activity Spectrophotometric method-Acetylthiocholine and dithio-bis- (nitrobenzoic acid) method 1 主题内容与适用范围WS/T 67-1996 本标准规定了血中胆碱醋酶活性的分光光度测定方法-一硫代乙酷胆碱-联硫代双硝基苯甲酸法。本法最低检测浓度为2单位/1mL血。本标准适用于正常人和接触有机磷类及氨基甲酸醋类农药者血中胆碱醋酶活
2、性的测定。2 原理胆碱醋酶水解硫代乙酷胆碱CASCh，Acetylthiocholine)生成硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱与琉基显色剂5，5-联硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB，Dithio-bis-nitrobenzoic acid)反应形成黄色化合物5-琉基-2硝基苯甲酸(TNB)。在波长412nm处比色定量。3仪器3. 1 分光光度计，5mm比色杯。3. 2 恒温水恪。3. 3 离心机。3. 4 血红蛋白吸管，20L。3.5 刻度吸管0.5mL ,2. 0 mL。3. 6 试管10mL。3. 7 容量瓶10mL。3.8 1/10万天平。4 试剂本标准所用试剂除另有说明外，均为分析纯试剂。4.
3、 1 实验用水:蒸馆水或具有同等纯度的去离子水。4.2 磷酸盐缓冲液。/15m mol/L ,pH 7.40):称取9.07g无水磷酸二氢饵(KH2P04)，用水溶解并稀释至1000 mL(甲液);称取23.87g磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20)，用水榕解并稀释至1000 mL(乙液)。取甲液19.2mL与乙破80.8mL i昆合即得。4.3 生理盐水:氯化纳8.5g/L。4.4 硫代乙酷胆碱(ASCh):称取72.3mg ASCh(生物试齐1)溶于生理盐水中，并稀释到10mL;置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。中华人民共和国卫生部1996-10-14批准1997-05-01实
4、施WS/T 67 -1 996 4.5 5，5-联硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)榕液:称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。出现黄色即弃用。4.6 抑制剂毒扁豆碱:取1mg左右柳酸毒扁豆碱，榕于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。4.7 1 m mol/L谷脱甘肤标准溶破:精确称取3.07mg还原型谷脱甘肤用水熔解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。此液1mL相当于1mol谷脱甘肤。因其易被氧化，应于用时配制，水必须先
5、经煮沸去氧冷却后使用。5 采样、运输和保存取末梢血滴入置有肝素抗凝剂的小试管中渥匀备用，或取10L末梢血直接加到盛有3mL pH 7.40的磷酸缓冲掖(4.2)的小试管中，棍匀，加塞，置冰瓶中运送，于4C冰箱内保存，尽快分析。6 分析步骤6. 1 标准曲线的绘制z取5支试管按下表配制标准管。标准管的配制管号。2 3 4 谷脱甘肤标准溶液(4.7).mL 。0.1 O. 2 0.3 0.4 水.mLO. 5 O. 4 O. 3 O. 2 O. 1 缓冲液(4.2).mL 1. 5 1. 5 1. 5 1. 5 1. 5 DTNB溶液(4.日.mLO. 5 0.5 O. 5 0.5 0.5 胆碱醋
6、酶活性单位，mol/mL(37C.6min) 。20 40 60 80 以水为参比，5mm厚比色杯在412nm坡长处读取吸光度，用各标准系列管的吸光度，分别减去零管吸光度之值，作为纵坐标，酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。6.2 样品测定取末梢血10L，放入盛有3mL磷酸盐缓冲液(4.2)的小试管中，棍匀后，取出1.5 mL置于另一小试管中，作测定管，原管作对照管。向对照管中加入一滴抑制剂液(4.6)，氓匀。将两管同置3TC水浴中预温510min(视室温而定)。向两管中分别加入已在3TC水陆保温的DTNB应用液(4.5)和ASCh应用掖(4.4)各0.5mL。加入ASCh液时，立即i十时并氓匀
7、。在37C水浴中准确反应6min后，即向测定管中加入一小滴抑制剂液(4.6)，氓匀以终止反应。离心除去血细胞，取上清液，放入5mm比色杯，于分光光度汁上412nm波长处，以水为参比，读取吸光度A;对照管的吸光度为A0 A减去A得吸光度差b.A，即为酶水解基质产生的硫代胆碱的显色深度，查标准曲线可得全血胆碱醋酶活性单位。7 计算测定人血样品时，以每毫升血样在3TC温洛6min，水解1微克分子(mol)基质为1单位。1mol谷脱甘肤能提供1mol琉基，其显色效应相当于1mol硫代胆碱，也相当于酶促使分解1mol基质(乙酷硫代胆碱)的效应。现测定管取血量为0.005mL，温浴时间为6mino每1mL
8、疏基标准液含谷脱甘肤1mol，故显色效应相当于0.1mL琉基标准液的酶活性单位为:1川机LX 0.1 mL X口市L叫位式中:0.1 mL一一疏基标准应用液的用量，如果是0.2mL琉基标准应用液就相当于40单位，余类推;0.005 mL 血样量。WS/T 67-1 996 8 说明8. 1 本法的检测限为2单位，测定范围为0，._，80单位。精密度。气批内在0.5%2.4%之间;批间在O. 5% ,._, 3. 9%之间。准确度t由于没有纯晶胆碱醋酶，不能直接测定回收率Q采取加入不同酶量，以实测酶暨的百分数与理论酶量的百分数之比衡量准确度。本实验按加入25%，50%和75%的酶(血样量)，其实
9、测值相当于各该理论值的94.6%，98.7%和100.0%。8. 2 为测定乙酷胆碱用的血标本，无论是以全血或用pH7.40磷酸盐缓冲液稀释后的血样，于普通冰箱(O，._，4C)保存7天，偏差5%。8.3 红细胞中的乙酷胆碱醋酶全部存在于细胞膜表面，因此，本测定方法不需将红细胞潜解。如有溶血，反而干扰本测定。8.4 对照管的吸光度读数超过O.07 ,._, 0. 08时，即说明有明显溶血，或DTNB自然分解，会使测定结果偏低。8.5 每个样品都需作自己的对照。8.6 抑制剂及其溶液宜妥为处置，严格防止污染器材及其他试剂。实验完毕后，所有器材需经肥皂水洗刷，用重铅酸饵硫酸清洗液漫泡，清水洗净，蒸锢水淋洗3次。以除去残留的抑制剂。8. 7 血清、脑、肝、肠及其他组织的组织匀浆，均可参照本方法作胆碱醋酶活性测定。但是需要先求取最适样品量，以决定取材量和温浴时间。反应完毕后，使用蛋白质凝固剂(三氯乙酸或纯乙醇)离心沉淀去除组织材料再作比色。实验动物的血样也可参照本方法作测定，唯需根据其酶活性调整取血量及温洛时间。附加说明:本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由上海医科大学公共卫生学院负责起草。本标准主要起草人薛寿征。本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所负责解释。
