1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准2003-08-11发布GB/T 5009.139一2003代替GB/T16344-1996 饮料中咖啡因的测定Determination of caffeine in beverages 2004-01-01实施军华人民共和国卫生费发布国国家标准化管理委员去前本标准代替GB/T16344 1996饮料中咖啡因的测定方法儿本标准与GB/T16344 1996相比主要修改如下:GB/T 5009.1392003 一一按GB/T20001. 42001(标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改。修改了标准的中文名称，标准中文名
2、称改为饮料中咖啡因的测定队本标准出中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准革盖率单位3上海市食品卫生监督检验所、上海:p.绞检疫局。本标准第一法主要起草人2何倩琼飞郑理、方有寒、李吉普漠。本标准第二法主要起草人=李绍良、庄镶谦、毛j援林、何傍王章。直在标孩子1996年首次发布，本次为第一次修订。197 GB/T 5009.139-2003 51 言咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄瞟岭化合物，化学名称为1，3，7-三甲基黄瞟岭，具有提神醒脑等剌激中枢神经作用，但易上瘾.为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200
3、mg/L，南斯拉夫规定不得超过120mg/L, 我国到目前为止咖啡因仅允许加入到可乐型饮料其含量不得超过150mg/kg，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定方法。简单、快速、准确。198 GB/T 5009.139-2003 饮料中咖啡因的测定1 范围本标准规定了可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量的测定方法紫外分光光度法和高效液相色谱法CHPLC)。本标准适用于可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的测定。本标准紫外法检出限g可乐型饮料为3mg/L;咖啡、茶叶及其
4、固体制品为5mg/l00 g;对咖啡和茶叶的液体制品为5mg/L. 本标准HPLC法检出限z可乐型饮料为0.72mg/L;茶叶、咖啡及其制品为1.8 mg/l00 g。第一法紫外分光光谱法2 原理咖啡因的三氯甲烧溶液在276.5nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。3 试剂3.1 元水硫酸俐。3.2三氯甲烧使用前重新蒸馆。3.3 15 g/L高锺酸饵溶液z称取1.5 g高锺酸饵，用水溶解并稀释至100mL. 3.4 亚硫酸销和硫佩酸饵混合溶液g称取10g无水亚硫酸铀(Na，S03)，用水溶解并稀释至100mL。另取10g硫氟酸御，用水溶解并稀释至100mL，然
5、后二者均匀混合G3.5 15%磷酸溶液z吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。3.6 200 g/L氢氧化锅溶液:称取20g氢氧化锅，用水溶解，冷却后稀释至100mL. 3.7 200 g/L醋酸铸溶液2称取20g醋酸镑Zn(CH3COOl， 2H，OJ加入3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL。3.8 100 g/L亚铁氟化饵溶液g称取10g亚铁氟化饵凡Fe(CN)6 3H，OJ用水溶解并稀释至100 mL. 3.9 咖啡因标准品:含量98.0%以上。3.10 咖啡因标准储备液z根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲炕配制成每毫升相当于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中
6、保存。4 仪器紫外分光光度计。5 分析步骤5.1 试样的处理5. 1. 1 可乐型饮料z在250mL的分液漏斗中，准确移入10.0 mL 20. 0 mL经超声脱气后的均匀可乐型饮料试样，加入5mL15g/L高锺酸饵溶液，摇匀，静置5min，加人混合溶液10mL，摇匀，加入50 mL重蒸三氯甲烧。振摇100次，静止分层，收集三氯甲炕。水层再加入40mL重蒸三氯甲烧，振摇199 GB/T 5009.139-2003 100次，静置分层。合并二次三氯甲炕萃取液，并用重蒸三氯甲烧定容至100mL.摇匀，备用。5. 1. 2 咖啡、茶叶及其固体试样z在100mL烧杯中称取经粉碎成低于30目的均匀试样0
7、.5g2.0g.加入80mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h.然后将浸出液全部移入100mL容量瓶中，加入2mL 200 g/L 醋酸钵溶液，加入2mL 100 g/L亚铁氟化饵溶液，摇匀，用水定容至100mL.摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0 mL20. 0 mL按5.1.1操作进行，制备成100mL三氯甲炕溶液，备用。5. 1. 3 咖啡或茶叶的液体试样g在100mL容量瓶中准确移人10.0 mL20. 0 mL均匀试样，加入2 mL 200 g/L醋酸铮溶液，摇匀，加入2mL 100 g/L亚铁氟化梆溶液，摇匀，用水定容至100mL.摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0 mL20. 0 mL按
8、5.1. 1操作进行，制备成100mL三氯甲烧溶液，备用。5.2 标准曲线的绘制从0.5mg/mL的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烧配制成浓度分别为0、5、10、15、20g/mL的标准系列，以0g/mL作参比管，调节零点，用1cm比色杯于276.5nm下测量吸光度，作吸光度-咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。5.3 测定在25mL具塞试管中，加入5g无水硫酸铺，倒人20mL试样的三氯甲统制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烧用1cm比色杯于276.5nm测出其吸光度，根据标准曲线(直线回归方程)求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度C(g/mL)。同时用重蒸三氯甲统作试剂空白。6 结果计算
9、按下列公式计算2式中s(c- co) X 100 1 000 =一一一一一一一一一x一一. ( 1 ) 1000 (C - CO) X 100 X 100 X 100 ,=( 2 ) V , X mX 1000 ( c - co) X 100 X 100 X 1 000 3= ( 3 ) V , XVX 1 000 X , 可乐型饮料中咖啡因含量，单位为毫克每升(mg/L)，X, 咖啡、茶叶及其固体试样中咖啡因含量，单位为毫克/每百克(mg/l00g) , X3 咖啡、茶叶及其液体制成品中咖啡因含量，单位为毫克每升(mg/U，c 试样吸光度相当于咖啡因浓度，单位为微克每毫升(g/mU，c, 试
10、剂空白吸光度相当于咖啡因浓度，单位为微克每毫升(g/mU，m 称取试样的质量，单位为克(g)，V一一移取试样的体积，单位为毫升(mL)，V，一一移取试样处理后水溶液的体积，单位为毫升(mU，7 精密度可乐型饮料=在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%，咖啡、茶叶及其制品s在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。200 GB/T 5009.139-2003 第二法高效液相色谱法(HPLC)8 原理咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。9 试剂9.1 甲醇HPLC试剂。9.2
11、乙脯HPLC试剂。9.3 三氯甲炕2分析纯，必要时需重蒸。9.4 超纯水:18.2Mn. 9.5 元水硫酸锅分析纯。9.6 氯化纳z分析纯。9.7 咖啡因标准品z纯度98%以上。10 仪器和设备10.1 液相色谱。10.2 色谱柱BondapakC18(30 cmX3. 9 mm id)。10.3 预柱RESAVE C18 10.4 超声清洗器(CQ250)。10.5 1.昆纤微孔滤膜。11 分析步骤11. 1 试样处理11.1.1 可乐型饮料11.1.1. 1 脱气试样用超声清洗器在40C下超声5mino 11. 1. 1. 2 过滤z取脱气试祥10.0mL通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5
12、mL，保留后5mL备用。11. 1. 2 咖啡、茶叶及其制成品s称取2g已经粉碎且小于30目的均匀试样或液体试样放入150mL烧杯中，先加2mL3 mL超纯水，再加50mL三氯甲烧，摇匀，在超声处理机上萃取1min(30 s二次), 静置30min，分层。将萃取液倾入另一150mL烧杯。在试样中再加50mL三氯甲烧，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加入少无水硫酸销和5mL饱和氯化锅，过滤，滤入100mL容量瓶中，用三氯甲烧定容至100mL.最后取10mL滤液按11.1.1.2操作进行。11. 2 色谱条件11. 2. 1 流动相z甲醇+乙腊+水=57+29+14(每升流动相中加
13、入0.8mol/L乙酸液50mU。11. 2. 2 流动相的流速:1.5 mL/min. 11.2.3 进样量，可乐型饮料10L，茶叶咖啡及其制成品5L20L。11. 3 标准曲线的绘制用甲醇配制成咖啡因浓度分别为0、20、50、100、150g/mL的标准系列，然后分别进样10L于人286 nm测量峰面积，作峰面积咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。11. 4 测定从试样中吸取可乐饮料10L或咖啡、茶叶及其制品10L进样，于286nm处测其峰面积，然后根据标准曲线(或直线回归方程)得出试样的峰面积相当于咖啡因的浓度c(g/mU。同时作试剂空白。201 GB/T 5009.139-2003 12 结果计算可乐型饮料中咖啡因含量(mg/L)=c咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量(mg/100g) =cXVX 100/(mX 1000) 式中:C一一由标准曲线求得试样稀释液中咖啡因的浓度，单位为微克每毫升(g/mL), V一一试样定容体积，单位为毫升(mL)，m-一试样质量，单位为克(g)。13 精密度可乐型饮料2在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%，咖啡、茶叶及其制品:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。202
