1、ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 911-2004 饲料添加剂葡聚糖酶活力的测定分光光度法Determination of 琶lucanaseactivity in feed additives -Spetrothoetric method 2005-01-04发布2005一02-01实施中华人民共和国农业部发布NY /T 911-2004 目。昌本标准的附录为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位:中国农业大学农业部饲料工业中心、芬兰饲料国际有限公司、广东溢多利生物技术股份有限公司、辽
2、宁众博饲料科技有限公司、北京中农博特生物工程技术有限公司、武汉新华扬生物有限公司。本标准主要起草人:陆文清、李德发、张丽英、朴香瓶、邢建军、刘兴悔。I 1 范围饲料添加剂阶葡聚糖酶活力的测定分光光度法本标准规定了用还原糖比色法测定饲料添加剂中仕葡聚糖酶的活力。NY /T 911-2004 本标准适用于饲料添加剂用的饲料酶产品，也适用于添加有仕葡聚糖酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品的最低检出量为1.0u/g。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的
3、各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。仕葡聚糖酶活力单位在37C、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/mL的伊葡聚糖榕液中降解释放1mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。4 原理仕葡聚糖酶能将自-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水洛条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算
4、反应液中纤维素酶的活力。警告:在处理酸、碱和配制DNS试剂时，请戴上保护眼镜和乳胶手套，实验应在通凤橱或通凤良好的房间进行。一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，应及时用大量的水冲洗。5 试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。5.1 氢氧化铀溶液，浓度c(NaOH)为200glL 称取氢氧化饷20.0g，加水洛解，定容至100mLo 5.2 乙酸溶液，浓度c(CH3C)H)为0.1mollL 吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mLo 5.3 乙酸铀溶液，浓度c(CH3CNa)为0.1mollL 称取三水乙酸纳1.36g，加水溶解，定容至10
5、0mL。5.4 乙酸一乙酸铀缓冲溶液，浓度c(CH3CH-CH3CNa)为0.1mollL，pH为5.5NY /T 911-2004 称取三水乙酸铀23.14g，J日人冰乙酸1.70 mL。再加水榕解，定容至2000mLo测定溶液的pH。如果pH偏离5.5，再用乙酸溶液(5.2)或乙酸纳溶液(5.3)调节至5.505.5 葡萄糖溶液，浓度C(，H20s)为10.0mg/mL称取无水葡萄糖1.000g，加乙酸一乙酸纳缓冲榕液(5.4)溶解，定容至100mLo 5.6 仕葡聚糖溶液，浓度为8.0glL 称取-葡聚糖0.40g，加入乙醇5.0mL润湿仕葡聚糖，再加入40mL乙酸一乙酸铀缓冲榕液(5.
6、4)。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至仕葡聚糖完全溶解。(注:在搅拌加热的过程中，可以补加适量的缓冲液，但是榕液的总体积不能超过50r。)然后，停止加热，继续搅拌30min，用乙酸一乙酸饷缓冲溶液(5.4)定容至50mLo -葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4t:避光保存，有效期为3do 冷冻保存，有效期为2个月(使用前，在4t:条件下解冻)。5.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯)，加水500mL，搅拌5s，水浴至45t:。然后，逐步加入100mL氢氧化纳溶液(5.1)，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化铀过程中，溶液温度不要超过48t:)。再逐步加人
7、四水酒石酸饵锅91.0g、苯酣2.50g和无水亚硫酸纳2.50g。继续45t:水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加人的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mLo用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。6 仪器与设备6.1 实验室用样晶粉碎机或碾钵6 2 分样筛孔径为0.25mm(60目)。6.3 分析天平感量0.001go6.4 pH ;十精确至0.0106.5 磁力搅拌器附加热功能。6.6 电磁振荡器6.7 烧结玻璃过滤器孔径为0.45pmo 6.8 离心机3000 r/mino 6.9 恒温水浴锅温度
8、控制范围在30t:60t:之间，精度为0.1t:。6.10 秒表每小时误差不超过5s。6.11 分光光度计能检测350nm 800 nm的吸光度范围。6.12 移液器精度为1Lo2 NY /T 911-2004 6.13 冰箱7 标准曲线的绘制吸取乙酸一乙酸铀缓冲溶液(5.4)4.0mL，加入DNS试剂(5.7)5.0mL，沸水浴加热5mino用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样O分别吸取葡萄糖溶液(5.5)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL, 分别用缓冲溶液(5.4)定容至100mL，配制成浓度为0.10mg
9、/mLO. 70 mg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL(做2个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液(5.4)和5.0mLDNS试剂(5.7)。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后，用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。8 试样溶液的制备固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛(孔径为0.25mm)，按照附录A中建议的称样量称取试样2份，精确至0.001g。加人40mL乙酸一乙酸
10、铀缓冲溶液(5.4)。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液(5.4)定容至100mL，在4t条件下避光保存24h。上离心机(6.8)离心3min，取上清液，再用缓冲溶液(5.4)做适当稀释(稀释后的待测酶液中日葡聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL0.08 U/mL之间)。液体样品可以直接用乙酸一乙酸铀缓冲溶液(5.4)进行稀释、定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04U/mL0.08 U/mL之间)。如果稀释后酶液的pH偏离5.5，需要用乙酸溶液(5.2)或乙酸饷溶液(5.3)调节校正至5.5，然后再用缓冲溶液(5.4)做适当稀释定容。9 测定步骤吸取10.0mL葡聚糖溶液(5.6
11、)，37t平衡20mino 吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，37t平衡lOmino 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37t平衡)，加入到刻度试管中，再加人5mLDNS试剂(5.7)，电磁振荡3s。然后加入2.0mL-葡聚糖榕液(5.6)，37t平衡30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样(参见7)为宅臼对照，在540nm处测定吸光度ABo吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37t平衡)，加入到刻度试管中，再加人2.0mL -葡聚糖(5.6)(已经过37t平衡)，电磁振荡3s，37t精确保温30mino加入5.0mLD
12、NS试剂(5.7)，电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样(参见7)为空白对照，在540nm处测定吸光度AEo10 试样酶活力按式(1)、式(2)计算 (AE - AB) X K + XD=dt1000uu-. (1) 式中:XD一一试样稀释液的日-葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL); AE一一酶反应液的吸光度;AB一一酶空白样的吸光度;K一一-标准曲线的斜率;3 NY/T 911-2004 一一标准曲线的截距;M一一葡萄糖的摩尔质量M(H1206)= 180.2 g/mol; t 一一酶解反应时间，单
13、位为分钟(min); 1000-转化因子，1 mmol = 1 000mol。XD值应在0.04U/mL0.08 U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XDXDj . ,. (2) 式中:X一一试样中日-葡聚糖酶的活力，单位为酶活力单位每克(U/g); Dj一一试样的稀释倍数。酶活力的计算值保留3位有效数字。11 重复性每个试样应取2份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留3位有效数字)。4 F葡聚糖酶活力，U/g2000 500-2000 200-500 50-200 10-50 1-10 附录A资料性附录)
14、建议称样量NY /T 911-2004 称样量，g0.1-0.2 0.2-0.5 0.5-1.0 1.0-2.0 2.0-5.0 5.0-10.0 5 叮CON-5HMZ中华人民共和国农业行业标准饲料添加剂世葡囊糖酶活力的测定分光光度法NY /T 911-2004 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销当+争奇争+9号印张0.75字数7千字2005年4月北京第1次印刷* 当&开本880mmx 1230mm 1116 2005年4月第1版印数:1-2000册定价:8.00元版权专有侵权必究举报电话:(010) 65005894 书号:16109. 516 NY厅911
