1、ICS 11.020 c59 备案号:20489-2007引TS中华人民共和国卫生行业标准ws 271-2007 感染性腹泻诊断标准Diagnostic criteria for infectious diarrhea 2007-04-17发布2007-10-15实施发布标准搜搜网各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 目次E I 范围2 术语和定义.3 诊断依据4 诊断原则25 诊断26 鉴别诊断.2附录A(资料性附录)常见感染性腹泻的主要特征. 3 A.1 沙门菌肠炎.3A.2 肠致泻性大肠杆菌肠炎.3 A.3 致泻性弧菌肠炎A.4 弯曲菌肠炎.4 A.5 小肠结肠炎耶尔森菌肠炎.
2、4 A.6 轮状病毒肠炎.4 A.7 诺瓦克病毒肠炎.4 A. 8 肠腺病毒肠炎.4 A.9 隐抱子虫病.A.10 蓝氏贾第鞭毛虫肠炎.5 附录B(规范性附录)实验室诊断方法.B.1 沙门菌检验.6 B.2 肠致泻性大肠杆菌检验.7 B.3 副溶血性弧菌检验. . . 11 B.4 弯曲菌检验.13 B.5 小肠结肠炎耶尔森菌检验.15B.6 轮状病毒检验 17 B.7 诺瓦克病毒检验四B.8 肠腺病毒检验.四B.9 隐抱子虫检验. . 20 B.四蓝氏贾第鞭毛虫检验21附录C(资料性附录)感染性腹泻的鉴别诊断.23 标准搜搜网w附.bzsos口.corn各类标准行业资料免费下载ws 271-
3、2007 目。吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。按照国家质检总局国家标准委公告(2005年第146号)，GB17012-1997(感染性腹泻的诊断标准及处理原则自本标准实施之日起废止。本标准的附录A、C是资料性附录，附录B是规范性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位:江苏省疾病预防控制中心及江苏省人民医院、南京市第二人民医院、中国疾病预防控制中心。本标准主要起草人:汪华、阐飘、方肇寅、冉陆、赵伟、李军、朱凤才、史智扬、顾玲、郭喜玲、张雪峰。皿标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 27 1-2007
4、 感染性腹泻诊断标准1 范围本标准规定了除霍乱、病疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级各类医疗E生机构及其工作人员对感染性腹泻的诊断和报告。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准:2.1 腹泻Cdiarrhea)每日排便3次或以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便，教液便、服血便或血便等。2.2 感染性腹泻Cinfectious di arrhea) 由病原微生物及其产物或寄生虫所引起的、以腹泻为主要临床特征的一组肠道传染病，本标准则仅指除霍乱、病疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻。3 诊断侬据3. 1 流行病学史全年均可发病，但具有明显季节
5、高峰，发病高峰季节常随地区和病原体的不同而异;细菌性腹泻一般夏秋季节多发，而病毒感染性腹泻、小肠结肠炎耶尔森菌腹泻等则秋冬季节发病较多。发病者常有不洁饮食(水)和(或)与腹泻病人、病原携带者、腹泻动物、带菌动物接触史，或有流行地区居住或旅行史;需排除致泻性的过敏原、化学药品暴露史及症状性、器官功能失调等非感染性腹泻病史。食(水)源性感染常为集体发病并有共进可疑食物(水)史;某些沙门菌(如鼠伤寒沙门菌)、肠致病性大肠杆菌CEPEC)、A组轮状病毒和柯萨奇病毒感染可在婴儿群体中引起暴发流行。主要病原体引起的感染性腹泻的流行病学特征参见附录A。3. 2 临床表现3.2. 1 每日大便次数二三3次，粪
6、便性状异常，可为稀便、水样便，勃液便、服血便或血便，可伴有恶心、呕吐、腹痛、发热、食欲不振及全身不适。病情严重者，常并发脱水、酸中毒、电解质紊乱、休克等，甚至危及生命。主要病原体引起的感染性腹泻的临床特征参见附录A。3.2.2 已排除由01血清群和0139血清群霍乱弧菌、志贺菌属、溶组织内阿米巴及伤寒沙门菌以及甲、乙、丙型副伤寒沙门菌所致的腹泻。3.3 实验室检查3.3.1 粪便常规检查粪便有性状改变，常为黠液便、服血便或血便、稀便、水样便。站液便、服血便或血便，镜检可有多量红、白细胞，多见于沙门菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、弯曲菌、耶尔森菌等细菌和某些病毒等所致的腹泻。稀便、水样便，
7、镜检可有少量或元红、白细胞，多见于肠产毒性大肠杆菌、轮状病毒、隐于包子虫、气单胞菌等所致的腹泻。3.3. 2 病原检查从粪便、呕吐物、血等标本中检出01血清群和0139血清群霍乱弧菌、志贺菌属、洛组织内阿米巴、伤寒沙门菌以及甲、乙、丙型副伤寒沙门菌以外的感染性腹泻病原体，或特异性抗原、特异性核酸片段检测1 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 阳性(详见附录B)。注:应用分子生物学方法开展病原检测时，应遵照相关规定执行。4 诊断原则临床诊断应综合流行病学资料、临床表现和粪便常规检查等进行。病原确诊则应依据从粪便、呕吐物、血等标本中检出病原体，或特
8、异性抗原、特异性核酸片段检测阳性。5诊断5. 1 临床诊断病例:应同时符合3.2、3.3.1, 3. 1供参考。5.2 确诊病例:应同时符合临床诊断和3.3.206 鉴别诊断应与霍乱、伤寒、副伤寒、细菌性病疾、阿米巴病疾、非感染性腹泻做鉴别诊断。参见附录C。2 标准搜搜网WWTAT.bzsoso. corn各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 附录A(资料性附录)常见感染性腹泻的主要特征A.l 沙门菌肠炎沙门菌肠炎包括除伤寒及甲、乙、丙型副伤寒以外的所有沙门菌感染。沙门菌为革兰阴性短小杆菌，无英膜，有动力，抗原结构复杂。在水、牛乳墓奥运金品中能存活一年以上，加热600C30min可灭
9、活，对含O.3mg/LO. 5mg/L余氯的氢嗣细毒饮用水及西育陆民敏感。染源为病人、带菌者、患病及带菌动物。以食源性和医源拼的每E且也苦触情人群普遍易感，幼儿(尤其1岁以内更敏感。全年均可发病，屋极费精W吃1菌感挠量是冒蝇旦、伤寒盟和败血型。胃肠型潜伏期多为6h2毡，急性起病，伴ML唱鹰，腥屠蠕黯写。a踊础L较易位堕尴水和电解质紊乱。粪便多为黄色或绿色稀水便，亦可带有蜘画姐姐，粪鲤睡醒町见蹭蟆辆自锢胞披红缉捕包，并电见巨噬细胞。泻的有5杆菌CEIEC)、肠EC)。该菌对热的水中可存活数方式，人群普遍次，萨色蛋花样，量较。成人常急性起颗粒。的水体、食品、牛普遍易感，成。伴有腹部瘟孪、恶心、呕吐
10、、头痛、肌痛脐部病情骂趋锺醋蝠衅泻，有的乒症王乱样，重度脱水、酸中毒，甚至死亡。肠侵袭性大肠杆菌(凹，、iWJ建噩噩躁啊木和食物引起暴发事lfL行，明町因接触传播形成散发病例;成人、儿童均可发病。明崔裴副提植病相似，临床上表现为举颖、腹A皇泻、里急后重、服血便。肠出血性大肠杆菌/产志费毒素幌啤酣嘻HF再晤。家禽;家畜为其贮存宿主和主要传染源，病人和无症状携带者也在愚民芝毒品化道以及接触传ii!.民翩感，但以老人、儿童为主;季节性明显，7月9月为流行高峰。主要恰在三主主主费嚷鄂瘟孪性疼痛、不适，初为水样便，继之转为鲜血性粪便，不发热或低热，可伴恶心、呕吐及上感样症状。大便镜检极少见炎症渗出性细胞
11、。多数病人表现为自限性疾病;少数病人可继发急性溶血性尿毒症综合征CHUS)以及血栓性血小板减少性紫癫。肠集聚性妻自附大肠杆菌CEAggEC)主要与小儿顽固性腹泻有关，症状可持续两周或以上。A.3 致泻性弧菌肠炎本标准中致泻性弧菌包括副溶血弧菌、河弧菌、拟态弧菌、霍利斯弧菌等。副溶血弧菌为革兰染色阴性、无芽抱、具有鞭毛，呈杆状或稍弯曲样，形态多变，嗜盐生长。氧化酶阳性，不发酵煎糖。临床分离3 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 株大多神奈川试验阳性，环境分离株一般为阴性。耐碱畏酸，对热敏感，560C3min死亡，一般消毒剂敏感。本病传染来源为带菌
12、的海产品，近海淡水鱼带菌较高。患者为传染源。本菌主要通过食物传播;各年龄均易感，以青壮年居多;7月9月为发病高峰。本病潜伏期2h4d，平均15h。起病急骤，腹泻、腹痛、恶心、呕吐、发热，重症可脱水，循环衰竭，少数有中毒性休克。粪便呈水样便、血水便或服血便，镜检可见白细胞和服细胞，常伴有红细胞，亦可见巨噬细胞。A.4 弯曲菌肠炎弯曲菌为微需氧，革兰染色阴性，多形态性，无芽抱，引起人类腹泻的主要是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌。空肠弯曲菌感染后肠道产生局部免疫，血中也产生抗0的IgG，IgM, IgA抗体，有一定保护力。该菌抵抗力不强，对热敏感，600C5min即可灭活，对物理和化学消毒剂均敏感。本病为人
13、畜共患病，主要传染源是家禽、家畜和鸟类，急性期患者和带菌者可为传染源。主要经食物和水传播，也可接触传播。人群普遍易感。全年均可发病，夏秋季多发。平均潜伏期3d时，主要症状为发热、腹泻、腹痛，少数伴有呕吐;粪便呈黄色水样便，部分为教液便和服血便。典型者脐周呈瘟孪性绞痛。粪便镜检可见白细胞或多量红细胞及服细胞。A.5 小肠结肠炎耶尔森菌肠炎为人畜共唐、疾病，系由小肠结肠炎耶尔森菌引起。该菌为嗜冷菌，革兰阴性无芽于包杆菌。可在20C450C生长。对湿热和化学消毒剂敏感。本病传染源为患者、带菌者、患病和带菌动物。多为消化道传染。人群普遍易感。全年均可发病，以秋、冬、春季较多。潜伏期刊lOd。主要表现为
14、突然发热，腹痛和腹泻，部分可有类似于阑尾炎症状、慢性反应性关节炎及结节性红斑以及败血症、突眼性甲状腺肿等。粪便呈水样稀便，可带素的夜，偶带版血，镜检可见白细胞、红细胞。A.6 轮状病毒肠炎人轮状病毒属于呼肠病毒科，基因组为11个片段的双股线型RNA，直径约为70nm75nm，呈球形，有双层衣壳，从内向外呈放射状排列，电镜下完整颗粒如车轮状。根据内层衣壳多肤构成的组特异性抗原，可分为AG七组，其中A、B、C组和人类疾病有关。外膜壳蛋白(病毒结构蛋白:VP)VP4和VP7是其主要中和抗原，能剌激机体产生相应抗体。VP4中和抗体的作用很弱，且有一定的交叉，而VP7中和抗体对机体有保护作用。病毒在外界
15、环境中比较稳定，在室温中可存活数月，耐酸、耐碱，550C 30min可使其灭活。本病传染源为患者和无症状携带者;传播途径主要经粪-口途径传播，也可经接触和呼吸道传播;人群均易感。A和C组主要感染儿童，以秋冬季节多见;潜伏期2d3d，主要症状为腹泻和呕吐，可伴发热和(或)呼吸道症状，严重者常伴有脱水及代谢性酸中毒，常并发肺炎、心肌炎、脑炎及病毒血症;大便为水样便或黄绿色稀便，无站液、无服血。B组主要感染成人，常于5月6月短期暴发流行;潜伏期2d划，以腹泻为主，伴恶心、呕吐、腹痛、乏力等症状。大便多为黄色水样便，元素占液及服血。镜检多元异常，少数可见少量白细胞。A.7 诺瓦克病毒肠炎诺瓦克病毒属于
16、杯状病毒科，诺如病毒属，为单正链RNA病毒，无包膜，直径27nm35nm，电镜下呈圆球状或多面状。有很强的耐乙醋、耐酸及耐热能力。传染源是病毒感染者和患者，主要是患者;粪-口传播途径为主，散发病例为人-人接触感染，暴发流行常由食物和水的污染造成;全年均可发病，但以秋冬多见;主要侵袭成人和大龄儿童。潜伏期24h48h，主要表现为腹泻、腹痛、恶心、呕吐，可伴有低热、头痛、肌痛、乏力及食欲减退;粪便为黄色稀水便，无服血和教液;镜检可见白细胞或脂肪滴。A.8 肠腺病毒肠炎腺病毒为无包膜的双股DNA病毒，至少分为47个血清型，其中40型和41型即肠腺病毒。病毒4 标准搜搜网www.bzsos口.com各
17、类标准行业资料免费下载ws 271-2007 颗粒呈球形，直径70nm90nm，病毒体呈类似通讯卫星样结构。腺病毒对酸碱及温度的耐受范围较宽，对脂、溶剂有较强的抵抗力，紫外线照射30min或560C30min可被灭活。传染源为患者和隐性感染者;可经接触、粪-口途径及呼吸道传播;婴幼儿多发;无明显季节性，秋冬季节多发;以散发和地方性流行为主。潜伏期刊lOd。临床症状以腹泻为主，可伴呕吐、发热，亦可有呼吸道感染症状。粪便呈水样便或稀水便，少数可有教液;镜检元服细胞及红细胞，可有少量白细胞。A.9 隐于包子虫病隐于包子虫病是由隐于包子虫引起的人兽共患寄生虫病。隐于包子虫是一种专性细胞内生长的机会致病
18、寄生原虫。隐抱子虫生活史包括卵囊、子抱子、滋养体、裂殖体、雌雄配子体及合子等阶段，仅需单一宿主即可完成，整个生活史约时15d完成。目前至少已发现的6种隐于包子虫中，感染人和哺乳动物的主要是微小隐于包子虫。虫卵囊对多种常用消毒剂和化学品有较强的抵抗力，在湿冷的环境下可存活数月或1年左右。感染隐于包子虫的动物和人以及元症状带虫者为传播本病的主要传染源。传播方式以粪口、于-口途径为主。感染与职业及免疫功能状态有关。农民、兽医及实验室工作人员多发。全年均可发病，但温暖、潮湿的夏秋季节多见。平均潜伏期7d。临床主要表现为腹泻、腹痛、恶心、呕吐、厌食、乏力及体重下降等，可伴有低热。免疫功能缺陷者，尤其是艾
19、滋病患者，缓慢起病，腹泻持续。大便可呈水样便或教液便，无服血，可有恶臭，粪镜检可见白细胞或服细胞。在免疫功能缺损患者中，偶有发生呼吸道感染等肠外表现，胆道感染亦有发现。A.10 蓝氏贾第鞭毛虫肠炎蓝氏贾第鞭毛虫为单细胞原虫，归属双滴虫目、六鞭毛科。营两分裂繁殖。其生活史分滋养体(营养繁殖阶段)和包囊(传播阶段)两个时期。滋养体主要寄生于人和动物的十二指肠或上段小肠，偶尔寄生于胆道或膜管。包囊在外界存活能力强，在氯化消毒水(0.5%)中可生存2d3d，在粪便中可维持10d以上。传染源为排出包囊的人和动物。可经水、食物、接触以及苍蝇等媒介传播。全年均可发病，夏秋季高发。我国各地均有发生，但以南方多
20、见。感染以小儿为多见。本病潜伏期1周2周。临床表现多为自限性腹泻、无症状带虫、慢性腹泻以及相关的吸收障碍和体重减轻。腹泻为突发性恶臭水样便、糊状或块状便。若未及时治疗可发展为慢性。寄生胆道可发生胆囊炎、胆管炎或累及肝脏肿大、阑尾炎等。5 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 B. 1 沙门菌检验B. 1.2 分离培养B. 1.2. 1 直接分离培采集病人急性期倾去上清液)标本接伊B. 1.2.2 增菌培养取新鲜粪便、呕吐物、菌液或亚晒酸盐增菌液等;EN6h拙，挑取增菌液分离培养，B. 1.3 鉴定B. 1. 3. 1 镜检附录B(规范性附录)实验
21、室诊断方法取中段尿或采用无菌导尿。所采集的中，在冷藏条件下送检;或将粪沙门菌革兰染色显微镜下可见革兰阴性小杆菌，大小(l3)mX(0. 40. 9)mo B. 1.3.2 生化试验挑取可疑菌落移种于三糖铁(或KIA)和MIU上，并作氧化酶、硝酸盐、KCN、赖氨酸试验;或移种于沙门菌生化鉴定板(条);或使用微生物自动鉴定系统(仪)进行鉴定。凡生化反应符合表B.2、表B.3的，以沙门菌属诊断血清作玻片凝集试验。B. 1. 3. 3 血清凝集试验0抗原试验用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。被AF多价O血清凝集者，依次用0:4;0:3，10;0:7 ;0:8;0: 9;0:2和0:
22、11等因子血清做凝集试验。符合沙门菌属6 标准搜搜网阳w.bzsoso.corn各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 定义，AF多价0血清不凝集，送有关部门进一步鉴定。H抗原试验先用多价H血清做凝集试验，如有一种或两种多价血清凝集，再用这种多价血清的各种H因子血清检查以确定第1相和第2相的H抗原。Vi抗原试验用Vi因子血清检测。表B.2沙门菌在三糖铁琼脂内的反应结果类型斜面Al A2 十A3 A4 注:+表示阳性;表示阴性;+1B.2.1 标本收采集病人急B. 2. 2.1 直接分即取新鲜粪便、呕性鉴别培养基或其他B.2.2.2 增菌培养对于疑似肠出血性转种于0157显色培养基(Ch
23、汤于3rc增菌培养，待有菌生板上挑取可疑菌落(详见表B.4)进选择性琼脂平板麦康凯琼脂伊红美蓝琼脂(卧在B)琼脂0157显色培养基(Chromagar0157 ) 山梨醇麦康凯琼脂底层产气+ +/一十+/ + 菌落特征硫化氢+ 十过21时，标本应放入，室温条件下运送。大肠杆菌发酵乳糖，在麦康凯琼脂呈桃红色不透明菌落黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深|的菌落肠出血性大肠杆菌0157:H7呈紫红色或浅紫色菌落肠出血性大肠杆菌0157: H7呈不发酵山梨醇的乳白色菌落或迟缓发酵山梨醇的红色菌落7 标准搜搜网各类标准行业
24、资料免费下载ws 271-2007 B.2.3 初步鉴定挑取可疑菌落作革兰染色镜检、生化反应并与大肠杆菌多价血清作玻片凝集试验，阳性者用单价血清作进一步鉴定。B.2.4 鉴定B. 2. 4.1 肠致病性大肠杆菌(EPEC)a)标本:水样或蛋花汤样便、呕吐物;b)革兰染色镜检及生化反应符合大肠杆菌特征;c)血清学鉴定符合EPEC血清型(表B.5);表B.5常见肠致泻性大肠杆菌的0血清群及血清型婴幼儿腹泻成人和儿童腹泻EPEC ETEC EIEC EHEC 0 20 。目0 06: K15: H16 08 : K.o : H9 0 28 ac 0157: H7 0 55 0 86 0111 08
25、: K25 : H9 08 : K.7 : H- 0112 026 : K62 : Hl1 0 114 0119 0 125 011 : H27 015 : H11 0 124 0 111 0126 0127 0 128 zo :H 0 25 : K7 : H2 0 136 0 142 0 158 025 : K98 : H-7 : H7 01姐027 : H20 063 : H12 0 144 0 73 : H5 078 : HI1 0152 ?8 : HI2 085 : H7 0164 011, : H21 。115: H51 1l 0127 : HI2 0128: H7 0128 : H
26、21 0139 : H28 0148 : H28 。1.9: H, 0159: H4 。159: H20 0 159 : H3 。166: H27 0169: H 注1)元动力的变异。d) PCR检测eae基因:引物对为SK1/SK2，扩增片段长度为881峙，序列如下:SK1: 5 -CCCGAA TTCGGCACAAGCA T AAGC-3 S曰:5 -CCCGGA TCCGTCTCGCCAGT A TTCG-3 EAEC J : K99 0101 : K99 PCR反应体积为50L:10mmol/L Tris-HCl (pH 8.3); 50mmol/L KCl; 0.1% Triton
27、X-100; 1. 5mmol/L MgClz ;2. 5U Taq酶;O. 2mmol/L dNTP; 5LDNA模板;引物SK1和SK2各O.125mol/ L;补足无RNA酶水至50L。同时设阴性、阳性及空白对照。PCR反应程序:950C预变性10min;940C变性1min，520C退火1min，720C延伸1min，共35个循环，最后一个循环720C延伸10min。电泳及结果判断:PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为881bp判为eae基因阳性。B.2.4.2 肠产毒性大肠杆菌(ETEC)8 a)标本:霍乱样水样便、呕吐物;b)革兰染色
28、镜检及生化反应符合大肠杆菌特征;c)血清学鉴定符合ETEC血清型(表B.5); 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 d)检出大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)和(或耐热肠毒素(ST)。测定LT可用兔肠段结扎试验、皮肤试验、ELISA、Biken试验、平板免疫溶血试验、DNA探针杂交和聚合酶链反应CPCR)等方法;测定ST可用乳鼠灌胃试验、ELISA、PCR、DNA探针杂交等方法。PCR同时检测elt和est基因:引物对分别为LTL/LTR和AL65/ AL125 ，扩增片段长度分别为322bp和147bp，序列如下:LT L : 5 -TCTCT A
29、 TGTGCA T ACGGAGC-3 LT R: 5 -CCATACTGATTGCCGCA AT-3 AL65 : 5 -TT AA T AGCACCCGGT ACAAGCAGG-3 AL125: 5CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATT AC-3 PCR反应体积为50L:10mmol/L Tris-HCl(pH 8. 3); 50mmol/L KCl; 0.1% Triton X-100; 1. 5mmol/L MgC12 ; 2. 5U Taq酶;O. 2mmol/L dNTP; 5LDNA模板;引物LTL和LTR各0.25mol/L;引物AL65和AL125各O.5mol/L
30、;补足无RNA酶水至50L。同时设阴性、阳性及空白对照。PCR反应程序:950C预变性10min;940C变性1min，520C退火1min，720C延伸1min，共35个循环，最后一个循环720C延伸10min。电泳及结果判断:PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为322bp和(或)147bp判为elt和(或)est基因阳性。B. 2.4.3 肠僵袭性大肠杆菌(EIEC)a)标本:细菌性病疾样便、呕吐物;b)革兰染色镜检为革兰阴性杆菌;c)生化反应:不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除O山外无动力，酒石酸盐阴性，赖氨酸脱竣酶阴性;d)血清学鉴定符合E
31、IEC血清型(表B.5); e)豚鼠角膜结膜试验(Sereny试验)、Hela细胞侵入试验阳性，PCR或DNA探针检测侵袭基因。PCR检测ipaH基因:寻|物对为ipaIII / ipaN ，扩增片段长度为619bp，序列如下:ipaIII :5-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3 ipaN : 5 -GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGT AC-3 PCR反应体积为50L:10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3); 50mmol/L KCl; 0.1% Triton X-100; 1. 5mmol/L MgClz; 2. 5U Taq酶;O. 2
32、mmol/L dNTP; 5L DNA模板;引物ipaIII和lpa凹各O. 125mol/L;补足无RNA酶水至50L。同时设阴性、阳性及空白对照。PCR反应程序:950C预变性10min;940C变性1min，520C退火1min，720C延伸1min，共35个循环，最后一个循环720C延伸10min。电泳及结果判断:PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为619bp判为阳性。B.2.4.4 肠出血性大肠杆菌(EHEC)a)标本:早期为水样便，后为血便、呕吐物;b)革兰染色镜检为革兰阴性杆菌;c)生化反应:不发酵或迟缓发酵山梨醇，赖氨酸、鸟氨酸、
33、鼠李糖、震糖、蜜二糖阳性，精氨酸、苦杏仁音阴性;d)血清型鉴定:其血清型为0157: H 7 (其中H7鞭毛抗原采用试管凝集试验法进行鉴定)，026: K62 : Hll、Olll(表B.5);0旧:H7的血清型亦可采用PCR检测0157和H7特异性基因的方法鉴定，引物序列见表B.6;9 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 引物名称01 57 -F 0157 -R flicH7-F flicHr R e) Vero细胞主Hly毒力基因。B.2.4.5 肠集a)标本:水b)革兰染aggRksl: 5 aggRkas2: 5 PCR反应吨1，1.
34、5mmol/L MgCl也;!o. 25mol/L;补足表B.60曰:H7特异基因检测引物序列引物序列5-TICAAACAGAGGACCATC-3 5-CCCAGCCACT AAGTA TIG-3 5-GCGCTGTCGAGTCTATCGAGC-3 5-CAACGGTGACTIT ATCGCCA TICC-3 PCR反应程序:EV锋m最后一个循环720C延轴L电泳及结果判断:FB.2.4.6 肠致泻性大肠杆引物名称引物序列SK1 5 -CCCGAATICGGCACAAGCATAAGC-3 , SK2 5-CCCGGATCCGTCTCGCCAGT A TICG-3 VTcom-u 5-GAGCG
35、AAAT AA TIT AT ATGTG-3 VTcom-d 5 -TGATGATGGCAATICAGTAT-3 , A45 5-TI AA T AGCACCCGGT ACAAGCAGG-3 10 目的基因片段大小bp rfbOl57 636 flicH7 625 A飞RNA酶水至50L，模板目的基因片段大小bp eae 881 stx 518 est 147 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载引物名称引物序列ws 271-2007 续表目的基因片段大小bp elt 322 ipaH 619 -? aggR 254 ALJ25 5-CCTGACTCTTCAAAAGA
36、GAAAATTAC-3 5七TCTCTATGTGCATACGGAGC-35, -CCATACTGA寸GCCGCAAT-3 5-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3 5-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGT AC-3 TL-pn T-T TU-7ipaill ipaN aggRksl aggRkas2 PCR反应体积为501. 5mmol/L MgCb ;2. 5UJfa o. 125mol/L;引物VL和AL125各O.5mol/lf; PCR反应程序，/5最后一个循环72。电泳及结果巧片段长度分别如B.3 副溶血性B. 3. 1 标本的急性期、用选择性琼脂
37、平板菌落特征氯化铀m;糖琼脂因不发酵煎糖菌落近似培养基颜色，绿色或蓝绿色35g/L氯化铀琼脂菌落无色不透明TCBS琼脂因不发酵煎糖菌落呈绿色或蓝绿色B.3.3 鉴定B. 3. 3.1 镜检挑取可疑菌落涂片镜检，副熔血性弧菌革兰染色后显微镜下可见革兰阴性无芽抱杆菌，细菌形态多11 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 变，有杆状、弧状、丝状及球状。不同的培养基上生长的菌体差异很大:在高盐琼脂上呈球杆状;在血琼脂上主要呈卵圆形，少数球杆状，也有丝状。悬滴标本运动活泼。B. 3. 3. 2 生化试验挑取可疑菌落转种三糖铁琼脂培养基并作氧化酶、耐盐生长试
38、验，并接种震糖、v-p、甲基红等生化反应培养基。具体内容见表B.9。综合镜检和生化反应结果判断菌型并报告结果。表B.9致病性弧菌鉴定表辛辛雀周鱼项目霍乱拟态副溶血创伤溶藻那提河弧弗尼斯弧菌霍利斯麦氏气单邻单弧菌弧菌弧菌弧菌弧菌菌弧菌(少女鱼弧菌弧菌胞菌胞菌弧菌弧菌)最适生长温度CC)37 37 37 37 37 25 ,35 37 37 25 25 ,36 37 28 37 氧化酶+ + 十+ + 十十+ + 十十十硝酸盐还原+ + 十+ + 十十十+ + 十十青定基质+ + + 十+ +/一+/一十/一十VP 十/一十/+ + 十/一十/一尿素酶/+ + L赖氨酸+ + 十十+ + 十/一一
39、/+十L-鸟氨酸+ 十+ +/一十/一十L-精氨酸十十十+/一十十葡萄糖产气十一/+十/一乳糖一/+十/一十+/一- /+ 麦芽糖+ + + 十十+ + 十+ + + +/一D-甘露醇+ + + 十/一+ + 十+ 十荒草糖+ 一/+ 十+ 十+ +/一L-阿拉伯糖十+ + 十十十/一纤维二糖+ + 一/+一/+十/一水杨素+ 十+/一+/一明胶酶+ + + + + + + +/一十在不同盐量肉汤中生长试验O% NaCl 十十十+ 3% NaCl 十十+ 十十+ + 十+ + + 十十6%NaCl 十/十/一+ 十/一十+ +/一十/+ +/一十8% NaCl + 十一/十十/一+/一10%N
40、aCl 十/一0/129敏感性10g S S R S R R R R S nd S R S 150g S S S S S S S S S nd S R S TCBS生长Y G G G Y Y Y Y G G Y Y G 注:+，阳性;一，阴性;十/一，多数阳性，少数阴性;一/十，多数阴性，少数阳性;nd，不定;S，敏感式，耐药汀，黄色;G，绿色12 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载B. 4 弯曲菌检验B. 4.1 标本收集ws 271-2007 于急性期、用药前采集病人新鲜粪便标本10g，立即送实验室进行培养，运送时间超过2h者，应放人Cary-Blair运送培养
41、基，40C冷藏送检;或将粪便标本直接接种增菌肉汤，并置于微需氧环境下，室温条件下运送。B.4.2 粪便标本直接镜检急性期患者的粪便可直接作涂片检查，革兰染色或用0.3%碱性复红单染色镜检，弯曲菌为细长、弯曲、呈S形或海鸥展翅状、元芽抱的革兰阴性菌。液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性，提示弯曲菌感染。B.4.3 分离培养方法B. 4. 3.1 培养条件本菌为微需氧菌，在6%O2、7%COz、7%Hz、80%N2条件下生长最好。可以使用:混合气体法;烛缸培养法;微需氧产气袋法。B. 4. 3. 2 直接培养急性期、用药前采集的病人新鲜粪便标本可直接划线接种CCD琼
42、脂平板(charcoal，cefoperazone , desoxycholate agar) ，370C微需氧培养24h72h。B.4. 3. 3 t曾菌培养病人新鲜粪便标本5g接种弯曲菌增菌肉汤(Preston肉汤)，370C微需氧培养24h72h后划线接种CCD琼脂平板，37C微需氧培养24h72h。B. 4. 3. 4 可疑菌落在培养基上的形态特征弯曲菌在CCD琼脂平板为灰色、湿润、沿划线生长，菌落常常呈不规则圆形。空肠弯曲菌通常为灰绿色的菌落，有或无金属光泽。结肠弯曲菌的菌落为奶油灰、湿润、突起。B.4.4 鉴定B. 4. 4.1 镜检B. 4. 4. 1. 1 革兰染色镜检弯曲菌为
43、细长、弯曲、呈S形或海鸥展翅状、无芽抱的革兰阴性菌。B. 4. 4. 1. 2 暗视野显微镜镜检液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性。B.4.4.2 生化鉴定将可疑菌落划线接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯，370C微需氧培养48h。挑取菌落做生化反应进行确认。弯曲菌的生化鉴别见表B.10。表B.10弯曲菌属种的生化鉴别表空肠弯曲菌结肠弯曲菌红嘴鸥弯曲菌Campylobacter jejuni Campylobacter coli Campylobctelari 过氧化氢酶试验+ 十+ 氧化酶试验十+ 十马尿酸盐水解试验十呵|味醋酸醋水解试验十+ 马尿酸盐水解试验
44、用接种环自哥伦比亚血琼脂平板刮取菌苔，接种到0.4mL含1%的马尿酸铀溶液中，振摇试管以分散培养物，置37C培养2h。然后向试管中加人0.2mL苟三酣试剂，将试管于37C放置10min，出现紫/蓝色者为阳性反应，元色或灰色为阴性反应。以阴性菌和阳性菌做对照。13 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 271-2007 口51噪醋酸醋水解试验取50L含10%日引噪醋酸醋的洛液，将其吸附到直径为6mm的纸片上，将纸片在空气中晾干。挑取可疑菌落生长物，将其直接涂布在纸片上，同时滴加一滴无菌蒸馆水，观察5min10min。纸片显示蓝绿色为弯曲菌反应阳性。B.4.5 菌种保
45、存将菌株接种在哥伦比亚血平板上，3rc微需氧培养48h，刮取菌苔，悬浮于含20%甘油的脑心肉汤，置于一700C冰箱保存。复苏时，将菌种管取出化冻并摇动均匀后，整管转种不加拢生素的弯曲菌增菌肉汤3rc培养48h72hoB.4.7 培养基B. 4. 7.1 弯曲菌增菌肉汤B. 4.7.1.1 成分A组布氏肉汤B组弯曲菌生长C组抗生素D组制法0.5mL和C组抗生素混合液O.5 B组混合液的制备:丙酣酸铀、焦、备用。1210C高压灭菌0.125g，加人2mL无菌蒸馆水，摇匀C组抗生素混合液的制备:分别称取多黠菌素B10mg、甲氧书院10mg、利福平10mg和放线菌目同100mg，加入2mL的1: 1丙酣和元菌蒸馆水溶液，摇匀备用。在对抗生素进行操作时的安全注意事项:使用的抗生素中包含有放线菌酣，如接触到皮肤，应立即用大量肥皂水冲洗;穿适当的保护性衣服，戴手套。B. 4. 7. 2 CCD琼脂B.4.7.2.1 成分布氏肉汤Lab-Lemco牛肉粉25g 10g 14 标准搜搜网w
