1、ICS 65. 020. 30 B 44 GB 中华人民共和国国家标准dEE 4llnHU 4lnunu nunuL nHUn/一ny一?-7AH户hv41t户。户hv户hu4l，nJ内/n/nuvnudnudnHdnHUanME A斗A斗nt叮lAEE,ABEt-JV 干中4E，nRUAAAA吁户hu户hunkuphunJn/nJnJ nudn叫JvnHdnwdAH.an-AAAAIda-aESEAt-,AEE TTTT JffJ/fJ/JIf BBBB GGGG 实验动物微生物学检测方法(2)Laboratory animal一-Microbiological examination -m
2、ethods 2001 - 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局发布GB/ T 14926. 46- 2001 78 前本标准规定了犬型钩端螺旋体的检测方法。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:范薇。中华人民共和国国家标准实验动物钩端螺旋体检测方法Laboratory animal- Method for examination of Leptospira sp. 1 范围本标准规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。本标准适用于犬型钩端螺旋体的检测。2 引用标准GB / T 14926.4
3、6- 2001 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/ T 14926.42-2001实验动物细菌学检测标本采集GB/ T 14926.43- 2001 实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/ T 14926. 50-2001 实验动物酶联免疫吸附试验3 原理钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合，产生凝集反应和形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深
4、浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。4 主要设备和材料4. 1 普通恒温培养箱。4.2 实体显微镜。4.3 恒温水浴箱。4.4 高速离心机。4.5 超声波细胞粉碎器。4. 6 酶标仪。4. 7 微量加样器，容量550f-tL和50200L。5 培养基及试荆5.1 犬型钩端螺旋体标准抗原。5.2 标准阳性血清。5. 3 标准阴性血清。5. 4 生理盐水。5.5 ELISA抗原。5.5. 1 钩端螺旋体培养中华人民共和国国家质量监督检验检疲总局2001-08 -29批准2002 - 05 -01实施79 GB/ T 14926.46- 2001 各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基
5、，28C培养5-7d o 5.5.2 生长良好的培养物用10000r/min离心30min，沉淀用PBS在相同条件下洗2次。5.5.3 上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，10000 r/min离心20min，上清即为ELISA抗原。5. 6 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬!gG抗体，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)。5. 7 阳性血清钩端螺旋体免疫SPF犬所获得的血清，或自然感染后所获得的血清。5.8 阴性血清无钩端螺旋体感染犬血清。5. 9 其他试剂溶液的配制见GB/T14926. 50一2001。6 检测方法6. 1 试管凝集实验6. 1.1 检测程序6. 1. 2 操作
6、步骤6.1.2.1 采样采血、分离血清。6. 1- 2. 2 血清稀释参照表1进行。血清倍比稀释加入标准抗原I37C温箱2h结果判定将待检血清以56C水浴灭活30min后备用。取96孔板，第1孔加入生理盐水0.16mL，以后每孔加入生理盐水0.1mL，一直加到第9孔。在第1孔中加入血清O.04 mL，1昆匀后，吸取0.1mL到第2孔，如此类推，直到第9孔，弃去0.1mL。80 GB/T 14926. 46- 2001 6.1.2.3对照另标明10，1l，12孔，第10孔加入阴性血清0.1mL，第II孔加入阳性血清0.1mL，第12孔加入生理盐水0.1mL。6. 1. 2. 4 加入抗原将各孔加
7、入标准抗原0.1mL，71昆匀，此时各孔血清稀释度为1:10 , 1 : 20 ,1: 40 , 1 : 80 , 1 : 160 , 1 : 320,1: 640 , 1 : 1 280 , 1 : 2560。具体操作见表1。置3TC温箱2h，取出后摇匀，用接种环挑取各孔中的反应物置于载玻片上，在暗视野下观察结果。表1钩端螺旋体定量显凝试验操作方法四孔板编号2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 生理盐水.mL0.16 0.1 0.1 O. 1 0. 1 O. 1 O. 1 0.1 O. 1 0. 1 待检血清.mLO. 04) O. 1) 0.1) O. 1) O. 1) O.
8、1万O. 1) O. 1) O. 1)弃去0.1阴性血清，mLO. 1 阳性血滑.mLO. 1 标准抗原，mL0. 1 0. 1 O. 1 0. 1 0.1 0.1 0. 1 O. 1 0. 1 O. 1 O. 1 0. 1 血清最终稀释度1/10 1/ 20 1/ 40 1/ 80 11160 1/ 320 1/ 640 1/1 280 1/ 2 560 6. 1.2.5 结果判定+十+:几乎全部钩端螺旋体呈蝴斟状或折光率高的团块，或有大小不等的点状或块状残片，仅有少数游离的钩端螺旋体。+:75%的钩端螺旋体被凝集，大部分呈块状或蜘蛛状，尚有25%菌体游离。+:50%左右的钩端螺旋体被凝集，
9、尚有50%菌体游离。+:25%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有75%菌体游离。一:全部菌体正常，分散，元凝集块，菌数与对照相同。待检血清凝集效价在1: 20达到+或以上时，均判为阳性反应。6. 2 酶联免疫吸附试验(ELISA)6.2. 1 包被抗原根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释。每孔100L，置3TC1 h后再4C过夜。6. 2.2 用洗撩液洗5次，每次3min，叩干。6.2.3 加样待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1: 40稀释，每孔100L，37C1 h，洗涤同上。6. 2. 4 加酶结合物用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔力n人100L，37C1 h，洗涤同上。6.2
10、. 5 加底物溶液每孔加入新配制的底物溶液100L，置37C，避光显色1015min。6. 2. 6 终止反应每孔加入终止液50L。6.2.7测A值在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。6.2. 8 结果判定在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。6. 2. 8. 1 同时符合下列2个条件者，判为阳性。a. 待检血清的A值注0.2;b. 待检血清的A值/阴性对照血清的A值注2.1。6.2.8.2 均不符合上述2个条件者，判为阴性。81 GB/ T 14926.46-2001 6. 2. 8. 3 仅有1条符合者，判为可疑，需重试。如为阳性则判为阳性。6. 2.8. 4 对阳性结果需重
11、试，如再为阳性则判为阳性。7 结果报告凡符合上述各项检测结果者作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。82 FCON-导.N叮!叮叮.Nm叮CON-5.N叮俨问筒。OONi止.N叮!.N叮FCON-.N白叮!二N叮俨同阁。同阁。同阁。华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(2)GB/T 14926.1-14926.6-2001 GB/T 14926.8-14926.17 2001 国中GB/T 14926.41-2叫01GB/T 14926.44-14926.49 2001 中国标准出版社出版北京复兴门外三里洞北街16号邮政编码:100045电话:68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售68517548 普* 印张6字数180千字2002年2月第一次印刷开本880X12301/16 2002年2月第一版印数1-2000峰7巳定价45.00网址书号:155066 1-18097 也略595-547 版权专有侵权必究举报电话;(010)68533533科目GB/T 14926. 1-2001 H
