1、CB/T 18645-2002 前言本标准主要是根据世界动物卫生组织WorldOrganization lor Animal Health (英),()ffice In1en tional des Epizootic (法).O!EJ1996年颁布的诊断试验和疫苗标准手册)(Manual01 standards for di agnostic tests &. vaccines)中3.2. 3、3.2.3.b的牛结核病和3.6. 8的禽结核病部分的内容制定的。考虑到我国的实际情况，对其中一些在我国还无法进行的检验技术作了删减(如:淋巴细胞增生试验;Y干扰素试验)。这样，一方面通过与国际同类要求
2、尽可能一致，以使我国适应国际贸易、技术和经济交流。另一直面，又考虑到我国的实际情况，使得技术方法具有可行性。本标准中的生物制品应符合中华人民共和国兽用生物制品质量标准)(992)的要求。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录，附录D是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:巾国兽医药品监察所。本标准主要起草人:毛开荣、陈向经、关孚时、罗玉峰。177 中华人民共和国国家标准动物结核病诊断技术Diagnostic techniques for tuberculosis ()f animal 1 范围木标准规定f动物结核病的检测U
3、j法和要求。丰标准迢JTJf功物结核病检测。2 定义、符号和缩畸语斗飞二标准:采用卡列符号和缩略活I刊3I).提纯lli1 1衍生物(purifedprotein d盯vative)。IU国际IJI.137(培养34周。该菌溶干燥、粗糙，里白色、黄色或橙色。叶中附着于蜻养基。在T，H吉养基上生长。3.2.2.7 I卡典分枝杆前生长快速，大部分(但不是全部)产生白色或具有橙色或黄色色素，常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。大多数非典现种类的生长速度比牛或人型结核分校忏商块。3.2.3 功物试验本试验是确结核病的重要依据，如能与涂片镜检和培养同时进行，则结果更为可靠。3.2.3.
4、1 试验动物在试验前，应迸行牛型结核分枝轩菌PPD和禽型结核分校杆菌PPD皮内变态反应试盼。3. 2. 3. 2 豚鼠对牛型和人型结核分枝杆菌敏感，对禽型结核分枝杆菌有抵抗力，常只能形成局部病州。3. 2. 3. 3 家免对禽型结核分枝柯菌高度敏感。对牛型结核分枝杆菌敏感。人型结核分枝杆菌虽可使其肺部形成少量病灶.但jif趋于痊愈而不致死。3. 2. 3. 4 处理过的病料约1mL3 mL，皮下或肌肉或腹腔内注射，每份病料至少接种2只同种动物。按种后30d左右，进行禽型结核分枝杆菌PPD和牛型结核分枝轩菌PPD皮内变态反应试验，如有阳性反忧.,iJ mJ检)J;巾的半数动物进行病理学观察、细菌
5、培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴悄反应nT于40d左右M检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察军3个月内l剧院观察。3. 2. 4 牛型、禽型和人哇占核分校杆菌鉴定方法见附录D(提示的附录), 4 结核分枝杆菌PPD皮肉变态反应试验4. 1 牛咱结核分校杆菌PPD皮内变态反应试验目结核分校杆菌PI引进行的皮内变态反应试验对检查活畜结核病是很有用的。该试验用牛型结核分校忏阙PID.1!行。4. 1. 1 牛的牛现结核分枝朽菌PPD皮内变态反应试验lli生后20d的牛即可用本试验进行检疫。4.1.1.1 操作为法a)注射51彷及术前处理:将牛只编
6、号后在颈捆!中部上二子，分之处剪毛(或提前一天盖l毛九三个月以内的核牛.也可在肩E甲部进行，宣径约10cm，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。注意，术部应此时1隘的病变。I II GB/T 18645-2002 b)注射剂量:不论大小牛只，律皮内注射。1mL(含20001U)。即将牛型结核分校杆菌PPD稀释成每毫升含2万IU后，皮内注射0.1mLo冻fPPD稀释后当天用完。c)注射方法:先以75%酒精消毒术部，然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌111).注射后局部应出现小范，如对注射有疑问时，应另选15cm以外的部位或对侧重作。d)注射次数和观察反应:皮内注射后经72h判定，仔细观察局部有
7、无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另J但1)以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射，再经72h观察反应结果。对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96h和120h再分别观察-次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。4.1. 1.2 结果判定a)阳性反应:局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mmb)疑似反应:局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm、小于4.0mm u阴性反应无炎性反应。皮厚差在2.0mm以下。凡判定为疑似反应的牛只，于第一次检疫60d后进行复检，其结果仍为疑似反应时句经60d再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。4. 1. 2
8、 其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验参照牛的牛型结核分校杆菌PPD皮肉变态反应试验进行。4.2 禽呻J结核分校杆菌PPD皮内变态反应试验禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最泛使用于家禽的试验。牛及其他哺乳动物也口I用牛刑结核分校杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行，以区分特异件和非特异性变态反应。4.2.1 禽的禽理结核分枝杆菌P1D皮内变态反应试验4.2. 1. 1 操作方法用10mmXO. 5 mm钊头肉垂皮内注射。1mL(O. 25万IU)禽型结核分枝杆菌11巾.48h后观察结果。4.2.1.2 结果判定阳件反应为接种部位肿胀，从5.0mm直径的小硬结
9、到扩展至其他肉垂与颈部的泛性水肿。火鸡肉要的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验，没有家禽的试验那样可靠。其他禽类也可用翼赎作试验，但结果一般不理想。水禽可接种脚蹊，但试验不敏感并经常与接种部位的感染相混淆。4.2.2 牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验4.2.2.1 操作方法与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同，只是禽型结核分枝杆菌PPD的剂量为每头。mL.含O.25万IU。即将禽型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2.5万IU后，皮内注射。ImL，4.2.2.2 结果判定a)对牛型结核分校杆菌PPD的反应为阳性(局部有明显的炎性反应，皮厚是大于或等于4.()mm).并且对牛型结
10、核分枝杆菌1PD的反应大于对禽型结核分校忏菌11)的反庇，1者皮差在2. () mm以卜，判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下，甚至对牛明结核分校杆菌P1D的反应略小于对禽型结核分校杆菌1PD的反应(反应差小于或等2.0mm).只要对牛理结核分校杆菌11D的反应在2.0mm以二，也应判定为牛理结核分校杆前11)皮肉变态反凶试验阳性牛。b)对禽i)纺核分校杆菌PPD的反应大于;H牛型结核分枝杆菌P1D的反应电两者的皮辈在2.0mm 以|今，判为禽型结核分枝杆商1ID皮内变态反应成验阳性。1 H 1 GB/T
11、18645 2002 对lC.i圭ii;性为副结核分枝杆菌或禽恐结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm 以F电占毛主1、l禽型结核分枝杆前PPD的反应赂小于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应(不超过2.0mm)，只耍对禽型结核分枝杆菌PPD的反庇在2.0mm以上，也院判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反1JL试验阳性斗。IS: GB/T 18645- 2002 附录A(标准的附录)标本消化浓缩法痰液或乳汁等样品.由于含菌量较少，如直接涂片镜检往往是旧111结果D此外.在培养或作动物试验H.J .常因污染杂商生长较快，使病原结核分校杆菌被抑制。下列几种消化浓缩方法可使检验标本小蛋白
12、质熔解、杀)(污染杂菌，而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡，并得到j浓缩。A1 硫酸消化法用4川6%硫酸浴液将痰、尿、粪或病如组织等投1 5之比例加入混合，然后胃37(作用1h- 2 h.经3000 r/min4 000 r/min离心30min，弃上清，取沉淀物涂片镜枪、格养和l接种动物。也n用硫酸消化浓缩后.在沉淀物巾加入3%氢氧化纳中和，然后抹片镜检、培养和接种动物。A2 氢氧化制消化法取主L氧化纳:15g10 区，御明矶2g.澳靡香草盼歧20mg (预先用60%1肉精配制成0.1%浓度.1但HI11，1按比例加入).茶馆水1000 mL 混合，即为氢氧化纳消化液。将被检的痰、尿、粪便或
13、病灶组织按1 5的比例加入氢氧化饷消化液中，混匀后.37(作Jjl2 h 3 h.然后无际H商fJO5%10%盐酸溶液进行中和，使标本的pH调到6.8左右(此时显淡黄绿色).以:1 000 r /min 4 000 r /min离心15min-20 min.弃上清.取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。在的料中加入等量的4%氢氧化纳溶液，充分摇荡5min-lO min，然后用3000 r/min离心15 min-20 mm，弃t肯，加l滴酷红指示剂于沉淀物中，用2mol/L盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。古痰液或小JtIi块中加入等量的1%氢氧化饷洛液，充分振摇15mi口，
14、然后用3000 r/min离心川min，1&沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。)(.1痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法:取1mol/L或HO氢氧化纳水溶液50mL. O. J mol月，拧橡酸纳50mL.N乙献一L.半脱氨酸。5g，混合。取痰一份，加上述溶液2份.作用24h 18 h.以3000 r /min离心15min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。A3 安替福民(antiformin)沉淀浓缩法溶液A:碳酸纳12g、漂白粉8g、蒸储水80mL熔液B，氮氧化纳15g、蒸馆水85mL应用时A、B两液等量混合，再用蒸馆水稀释成15%20%后使用，该溶液须存放于棕色瓶l材。将被检样品
15、置于试管中，加人34倍量的15%20%安替福民溶液，充分摇匀后:17C作用lh.IJll12倍量的)(菌蒸惰水，摇匀，3000 r/min4 000 r/min离心20min-30 min，弃上清沉说:物加蒸饱水恢复原最后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。附录B(标准的附录)蔓尼氏抗酸染色液配制方法B1 苯酣复红染色液碱f!复纠饱和l酒精溶液(每100mL95%酒精加3日碱性复红)10mL，5/苯盼溶液日()口11., 占1日I k:J GB/T 18645-2002 合后用滤纸滤过。B2 3%盐酸酒精脱色液浓盐酸3mL，95%酒精97mL，混匀。83 骆氏美蓝染色液叶i液z美蓝0
16、.3g，95%酒精30mLo 乙液，0.01 %氢氧化御榕液100mLo 将ljJ乙两液相混合。C1 配氏(Petragnane)培养基C1.1 成分附录C(标准的附录)培养基配制方法新鲜脱脂牛奶450mL，马铃薯淀粉18g，天门冬素(或蛋白脐、)2. 6 g，去皮马铃薯225g，鸡蛋白个除去1个蛋清)，甘油40日，2%孔雀绿水溶液30mLC1. 2 制法将马铃薯去皮擦成士生，加入马铃薯淀粉、天门冬素(或蛋自陈、脱H脂旨牛奶置烧杯中水浴煮沸4o mm._6o min 海洗净)儿川，i混昆匀后用囚层纱布过滤除渣。最后加入甘油和孔雀绿水溶液搅拌均匀，分装于灭菌的试管中。将分装培养基的试管置血清凝固
17、器(或流通蒸汽锅)内，间歇灭菌3次，每天次，第一天65C灭菌30 min，第二二、二天75C80 C灭菌30mino C1.3 用途分离府养结核分枝轩菌用。C2 LJ (LowensteinJensen)培养基C2.1 成分无水磷酸二氢御(KH，PO，)2.4g，硫酸续(MgSO， H20) O. 24臣，拘橡酸馁。6g , DL夭门冬素(DL Asparagin)3. 6 g，时油12g，蒸馆水600mL，马铃薯粉30g，鸡蛋(约30个)1000时，2%孔雀绿点浴液20ml.。C2.2制法将磷酸二氧仰、硫酸侯、拘橡酸镜、甘油和蒸馆水混合，加热使溶解。取马铃薯粉加入上述溶液内，随加随搅拌，水浴
18、煮沸1ho鸡蛋用75%酒精消毒外壳后，打开，将蛋清和蛋黄充分搅匀，4层纱布过滤。待I述力日马铃薯粉的盐溶液冷却至50C时，加入鸡蛋液和孔雀绿，并充分搅匀。分装.80(灭菌30min后，37C培养48h，若无杂菌污染即可使用。C2.3月1途供培养结核分枝杆菌用。C3 青霉素血液琼脂培养基C3.1 J戊分l拍1GB/T 18645-2002 琼脂1.5 g，中性甘油1mL，蒸馆水74mL，兔全血(或牛全血)25 mL，青霉素(2000IU/mL) 1. 85 mLo C3. 2 制法将琼脂、中性甘油及蒸饱水混合，经103.4kPa 15 min灭菌。待冷却到50C时加入兔全血(或牛全血)与青霉素，
19、混合后分装，经3TC培养48h，无杂菌污染即可使用。C3. 3 用途供培养结核分校杆菌用。C4 噎吩2酸脐(T，H)培养基C4.1 成分L-J培养基，TzH。C4.2 制法取L-J培养基(见C2)100mL，水浴煮沸，加T，H1 mg，充分搅匀。分装;80C灭菌30min后，37C 培养48h，若无杂菌污染即可使用。C4.3 用途供结核分枝杆菌生化鉴定用。附录D(提示的附录)牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定牛型、禽型和人型结核分校杆菌的鉴定，主要依据生化试验和动物试验。D1 生化试验牛型、禽型和人型结核分校杆菌的生化试验特性见表D1。表Dl生化试验类型烟酸试验TWEEHO |耐热接触酶试验问水
20、解试验盐还原尿素酶试验T2H抗性试验牛型结核分枝杆菌十禽型结核分枝杆菌十十人型结核分枝杆菌+ 土十十卜D1.1 烟酸试验D1. 1. 1 试验方法以热蒸馆水浸泡固体培养基上的培养物15min-30 min，洗下。每个培养物分装人2支试管中，每管0.4mL，再加入3%联苯胶乙醇溶液0.2mL然后向其中一管加入10%漠化佩溶液(此液剧毒，应在通风橱内操作)0.2mL D1.1.2 结果判定凡含10%澳化氟溶液的试管出现桃红色沉淀，另一管只产生无色沉淀者要IJ为阳性g两支试管都为产生无色沉淀者判为阴性。185 D1.2 吐温80CTween80)水解试验D1.2.1 试验方法GB/T 1864520
21、02 向100mL磷酸缓冲液(1/15mol/L, pH 7.0)中加入。.5mL Twccn-80、2mL 0.2%中性红溶液。经112kPa灭菌20min，分装于试管中，每管2mL。在4C10C可保存2周。取上述试管，加入10m恼L的菌液。.5mL.37C培养.3d5 d观察结果。D1. 2. 2 结果判定试管内由原来的玻础色变为桃红色或红色者判为阳性。元颜色变化为阴性。D1.3 耐热接触酶试验D1. 3. 1 试验方法用生理盐水配制出5mg/mL10 mg/mL的菌液，分装试管，每管0.5mL.以68C水浴20min，冷却后加入0.5mL过氧化氢CH202)和Tween-80混合液(10
22、%Tween80加等量30%H22)。观察结果。D1. 3. 2 结果判断肉眼观察，如有多量小气泡自管底升起，即为阳性。否则为阴性。D1.4 硝酸盐还原试验D1.4.1 试验方法在100mL pH7. 0的磷酸盐缓冲液中，加入硝酸饷CNaN， H,O) 85 mg.经112kPa灭菌20min 后分装，每管2mLo 向上述溶液中加入10mg/mL的菌液，经37C水浴2h后，加入l滴2倍稀释的盐酸.2滴0.2%氨苯磺胶.2滴O.1 %N甲基盐酸二氨基乙烯。在4C10C存放2周后判断结果。D1. 4. 2 结果判定呈粉红色至紫红色者为阳性。无色或淡粉色为阴性。D1.5 尿素酶试验D1. 5. 1
23、试验方法将被枪材料接种尿素培养基。37C培养。D1. 5. 2 结果判定在尿素培养基上长出结核分校杆菌菌苔(或菌落).并且使培养基变成红色，即为阳性。培养基不变色为阴性。D1.6 T2H抗性试验D1. 6. 1 试验方法将被检材料接种T2H培养基和LJ培养基。37C培养。D1. 6. 2 结果判定在上述两种培养基土长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落)即为阳性。若在LJ培养基上生长，而在T2H培养基上不生长，则为阴性。D2 动物试验牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验特性见表020表02试验动物豚鼠兔牛型结核分校杆菌易感易感禽型结核分枝杆菌不易感昂感人型结核分枝轩菌易感不易感186 鸡不昂感易感不易
24、感GB/T 18645-2002 D2.1 试验方法试验动物在试验前，应进行结核分枝杆菌PPD皮肉变态反应试验。豚鼠用牛型结核分校轩菌PPD检测;.l号用禽型结核分校轩商PPD检测;兔用牛型和禽型结核分校杆菌PPD检测。将处理过的病料约1mL3 mL.选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物，每份病料至少接种2只同种试验动物。接种后30d左右，对豚鼠用牛型结核分校杆菌PPD检测;对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检梗j;x1 兔用牛J.!i结核和禽型结核分枝抨菌PPD检测。如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应，可于40d
25、左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。D2.2 结果判定D2. 2. 1 牛型结核分校杆菌感染鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分校杆菌。同时从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌。或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。D2. 2. 2 禽型结核分校杆菌感染豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测阴性，元任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分校杆商。同时，从兔和鸡检测到结核分校杆菌。或兔或鸡的禽型结核分校杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。D2. 2. 3 人型结核分校杆菌感染仅从豚鼠检测到结孩分枝杆菌。或仅豚鼠的牛结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。lR7
