1、ICS 67050X 04 雷雪中华人民共和国国家标准GBT 22960-2008河豚鱼和鳗鱼中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of cefazolin，cefapirin，cephalexin，cefalonium，eefquinome residues in fugu and eelLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施宰瞀髅鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会及11刖 置本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中
2、华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李学民、王贺琴、母健、曹彦忠、刘晓茂、庞国芳。GBT 22960-2008河豚鱼和鳗鱼中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定 液相色谱一串联质谱法GBT 22960-20081范围本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定。本标准的方法检出限：头孢唑啉为10,ugkg；头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟为20 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的
3、引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 63791-2004，IS0 5725 1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 v-2004，1S0 6725 2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试
4、验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样中五种头孢菌素药物残留用乙腈提取，旋转蒸发除去乙腈，用水定容，液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸。45正己烷。46乙腈饱和的正己烷：取100mL正己烷(45)和50mL乙腈(43)于250mE分液漏斗中，振摇1 min，静置分层后，弃掉乙腈。47标准物质：头孢唑啉(cAs：25953199)、头孢匹林(CAS：2435660-3)、头孢氨苄(CAS：16549567)、头孢洛宁(CAS：5
5、575213)、头孢喹肟(CAS：118443893)，纯度99。48 10 mgmL五种头孢菌素标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质(47)，分别用水配制成浓度为10 mgmL的标准储备溶液。储备液贮存在一18冰柜中。49五种头孢菌素标准混合工作溶液：根据需要吸取适量的每种头孢菌素标准储备溶液(48)，用水稀释成适当浓度的标准混合工作溶液。1GBT 22960-2008410滤膜：02“m。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg，001 g。53均质器。54微量注射器：25 pL，100 pL。55刻度样品管：5 mL，精度为01 mL。56
6、高速冷冻离心机：带有50 mL具塞离心管，转速达到10 000 rrain以上。57氮气浓缩仪。6试样制备与保存61试样的制备从全部样品中取出有代表性样品约l kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样的保存将试样于一18保存。7测定步骤7 1试样溶液的制备称取5 g试样(精确到001 g)置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈(43)，使用均质器(53)均质1 rain，提取液使用高速冷冻离心机(56)在10，10 000 rmin离心10 rain，把上层提取液移至另一离心
7、管中。用15mL乙腈重复提取一次，合并两次的提取液，并加入10mL乙腈饱和的正己烷(4，6)，振荡lrain，弃掉正己烷。把提取液移至100mL鸡心瓶中，在40旋转蒸发除去乙腈，用2mL水溶解残渣，摇匀后，样液过02 pm滤膜(410)，供液相色谱一串联质谱仪测定。72空白样品添加标准混合工作溶液的制备分别准确移取适量五种头孢菌素标准混合工作溶液(49)，添加到50 g样品中，按照71步骤操作，制得头孢唑啉浓度分别为10 pgkg、20 pgkg、40 pgkg、100 pgkg；头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟浓度分别为20 pgkg、40 pgkg、8o pgkg、20 vgkg四个
8、样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱一串联质谱仪测定。73测定条件731液相色谱参考条件a) 色谱柱：ZORBAX SB-C18，35 pm，150 mm21 ram(内径)或相当者；b) 流动相组成、流速及梯度程序见表1；c)柱温：30；d)进样量：20 pL。表1流动相梯度程序及流速时间min 流速(tLmin) 水(含01乙酸)“ 乙腈000 200 950 5O200 200 950 50201 200 400 600表1(续)GBT 22960-2008时间rain 流速(pLmin) 水(含01乙酸) 乙腈“800 200 400 500801 200 950 501500 200
9、 950 50732质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d) 电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：0055 MPa；f)气帘气压力：0，079 MPa；g)辅助气流速：6 Lmin；h)离子源温度：400；i) 定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)见表2。表2五种头孢菌素的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 去簇电压v 碰撞气能量V455324 17头孢唑啉cefazolin 456324 504561 56 24424292 2
10、3头孢匹林cephaplrll2 424292 4542415234348158 14头孢氨苄 cephaexin 348158 40348174 22459152 29头孢洛宁 ceIalonium 459152 35459123 18529134 2l头孢喹肟 cefquinome 529194 49329396 1974液相色谱一串联质谱测定741定性测定选择每种待测物质的1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在25之内；样品谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的谱图中离子相对丰度相比，偏差不超过表3规定的
11、范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许的最大偏差 士20 土25 士30 土50742定量测定用72制备的空白样品添加标准混合工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中五种头孢菌素的响应值均3GBT 22960-2008应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，五种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加回收率数据参见附录B中的表B1。75平行试验按上述步骤，对同一试
12、样进行平行试验测定。76空白试验除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。8结果计算试样中五种头孢菌素残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：xc筹揣 t(1)m 1 UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次
13、独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中五种头孢菌素添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 五种头孢菌素添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克头孢菌素名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R头孢唑啉 10-i00 19r-0971 9lgm一1053 5 lgR=0890 8Igm一0514 8头孢匹林 2020 lgr=1221 3lgm一1157 7 R一0194 7m+0122 3头孢氨苄 2020 lgr-1050 4lgm一1025 7 IgR=0916 7lgm一0605 5头孢洛宁 2020 lgr=1070 4lgm一1117 3 LgR=0852 3lgm
14、0609 9头孢喹肟 2020 Igr=0665 6lgm一0731 3 lgR=o926 1lgm O650 2注：m为两次测定结果的算术平均值。如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中五种头孢菌素添加浓度范围及再现性方程见表4。附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图五种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。之趔型譬靼型督蚓型菩GBT 22960-2008rain头孢匹林trainrain引 r趔目罾图A1 五种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱圈GBT 22960-2008附录B(资料性附录)回收辜五种头孢菌素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 五种头孢菌素添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称 添加浓度(tgkg) 平均回收率10 82620 857头孢唑啉40 89?100 97220 81740 909头孢匹林8o 98220 9572o 85940 92 5头孢氨苄8，o 103420 8982o 8644o 896头孢洛宁8o 965ZO 9342，0 82540 1056头孢喹肟80 95920 9436
