1、ICS 67050X 04 圆园中华人民共和国国家标准GBT 22969-2008奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of streptomycin，dihydrostreptomycin and kanamycinresidues in milk and milk pOwderLCMSMS method200812-31发布 200905-0 1实施宰瞀鳃紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”。刖 置本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国
2、秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、曹亚平、杨志伟、庞国芳。GBT 22969-2008奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22969-20081范围本标准规定了奶粉、牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于奶粉、牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为100 pgkg，奶粉中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为80o pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
3、凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 63791-2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-200
4、8，ISO 3696：1987，MOD)3原理奶粉或牛奶试样中的抗生素用磷酸溶液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，用苯磺酸型和羧酸型固相萃取柱净化。液相色谱一串联质谱仪(EsI+)检测，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为优级纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44甲酸。45浓磷酸。46磷酸氢二钾(K。HPO。)。47三氯乙酸(czHCI。Oz)。48庚烷磺酸钠(C，H。NaO。SH。O)。49 5磷酸溶液(1+19)：取50 mL浓磷酸(45)，用水定容至1 L。410 02 molL磷酸盐缓冲溶液：pH=85。称取348 g磷酸氢二钾(46)用水溶解
5、，定容至l L，用氢氧化钠溶液调节pH=85。411三氯乙酸溶液：50(质量分数)。取20 g三氯乙酸(47)，用水定容至20 mL。412 001 molL庚烷磺酸钠溶液：称取220 g庚烷磺酸钠(48)，用水溶解，定容至1 L。1GBT 22969-2008413 SPE洗脱溶液：取4 mL甲酸(44)，用001 molL庚烷磺酸钠溶液(412)定容至100 mL。414 25甲醇溶液(1+3)：取25 mL甲醇(42)，用水定容至100 mL。415 标准物质：链霉素(CAS：3810740)、双氢链霉素(CAS：128461)和卡那霉素(CAS：25389940)；纯度均大于等于98。
6、416 10 mgmL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质(415)，分别用03乙酸水溶液溶解并配制成10 mgmL的标准储备溶液。避光保存于一18冰柜中。417 01 pgmL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液(416)，用03乙酸水稀释成01 pgmL的混合标准溶液。避光保存于一18冰柜中。418苯磺酸型固相萃取柱(500 mg，3 mL)或相当者。使用前依次用5 mL甲醇和lO mL水预处理，保持柱体湿润。419羧酸型固相萃取柱(500 mg，3 mL)或相当者。使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。420滤膜：0
7、2 pm。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53液体混匀器。54固相萃取装置。55振荡器。56真空泵：真空度应达到80 kPa。57微量注射器：25 pL，100 pL。5，8 pH计：测量精度士002 pH单位。59具塞离心管：100 mL。510刻度离心管：5 mL。511贮液器：50mL。512离心机：转速4 000 rmin以上。6试样的制备与保存61试样的制备实验室样品混合均匀，分出05 kg作为试样。62试样保存试样置于一18冰柜，避光保存。7测定步骤71待测样品溶液的制备7。1，1牛奶样品提取和初净化称取牛奶样品8
8、g(精确到001 g)，置于i00mL离心管中，加入30mL 5磷酸溶液(49)，置于振荡器上振荡提取10 rain，加入3 mL三氯乙酸溶液(411)涡旋混合后在4 000 rmin下离心10 rain。上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱(418)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2 mLmin的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用5 mL 5磷酸溶液(49)和10 mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱(418)，弃去全部流出液。用20 mL磷酸盐缓冲溶液(410)洗脱至50 mL离心管中。2GBT 22969-2008712奶粉样品提取和初净化称取奶粉样品1 g(精确到001
9、 g)，置于100 mL离心管中，加入8 mL水，涡旋混合后，再加入30 mL磷酸溶液(49)，置于振荡器上振荡提取i0 min，加入3 mL三氯乙酸溶液(4ii)涡旋混合后在4 000 rrain下离心10 rain。上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱(418)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2 mLmin的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用5 mL 5磷酸溶液(49)和10 mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱(418)，弃去全部流出液。用20 mL磷酸盐缓冲溶液(410)洗脱至50 mL离心管中。713样品溶液再净化上述洗脱液倒人下接羧酸型固相萃取柱(419)的贮液器中
10、，在固相萃取装置上使样液以小于2 mLmin的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10 mL水和10 mL 25甲醇溶液(414)洗涤羧酸型固相萃取柱(419)，弃去全部流出液。减压抽干羧酸型固相萃取柱(419)30 rain。用2 mL SPE洗脱液(413)洗脱至5 mL刻度离心管中，用SPE洗脱液(413)定容至20 mL，混匀后过02pm滤膜(420)，供液相色谱一串联质谱测定。72基质混合标准校准溶液的制备721 牛奶基质混合标准校准溶液的制备称取五个阴性牛奶样品10 g(精确到00l g)，分别置于100 mL具塞离心管中，加入适量混合标准溶液(417)，制成链霉素、
11、双氢链霉素和卡那霉素含量均为50*gkg、100,ugkg、200,ugkg、1000 P-gkg和2000 t,gkg的基质标准溶液。其余按711和712步骤操作完成。722奶粉基质混合标准校准溶液的制备称取五个阴性奶粉样品1 g(精确到oOl g)，分别置于100 mL具塞离心管中，加人适量混合标准溶液(417)，制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为400 pgkg、800 pgkg、1600 pgkg、8000 pgkg和1 6000 pgkg的基质标准溶液。其余按712和713步骤操作完成。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：Atlantis C1
12、8，35 pm，150 mm21 ram(内径)或相当者；b)柱温：40；c) 进样量：30 pL；d) 流动相：流动相A为01甲酸水溶液，流动相B为01甲酸乙腈溶液，流动相c为甲醇。梯度洗脱参考条件见表1。表1 液相色谱梯度洗脱参考条件时间min 流速(pLrain) 流动相A 流动相B 流动相CO 200 85 10 5301 200 60 35 5600 200 60 35 5601 200 85 10 516 00 200 85 10 5732质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)GBT 22969
13、-2008d) 电喷雾电压(IS)：5 000 V；e)辅助气(AUX)流速：7 Lrain；f)辅助气温度(TEM)：550；g) 聚焦电压(FP)：150 V；h)链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2。表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数定性离子对 定量离子对 去簇电压(DP) 采集时间 碰撞能量(CE)化合物名称(rez) (仇2) V V链霉索 582263 45582263 110 100(streptomycin) 582246 5545双氢链霉素 584263584263 100 lOO(dihydrostreptomycin) 584246 55卡那霉素 4851
14、63 34485163 50 100(kanamycin) 485324 2374液相色谱一串联质谱测定74，1定性确证每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20(K50 10K20 K10允许最大偏差 土20 土25 士30 士50742定量测定外标法定量：在仪器最佳工
15、作条件下，对链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验不称取样品，其余均按试样步骤进行。77回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算链霉素、双氢链霉
16、素和卡那霉素的测定按式(1)计算：4X=c暑獬 m UuU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)V样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度GBT 22969-200891一般规定本标准的精密度数据是按GBT 63791和GBT 63792规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4。表
17、4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R链霉素 502000 lg r一0844 819卅一0842 8 19R-0910 2 lgm一0814 5双氢链霉素 502000 lg r一0899 019m 0950 8 lgR一0944 9 lgm 0920 5卡那霉素 5O2000 lg r=O889 6tgm 0920 8 lgR一0726 3 lgm 0691 6注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再
18、现性限R。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 22969-2008附录A(资料性附录)多反应监测(MRM)色谱图链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。a趔型督链霉素582263卡那霉素485163图A1 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图o蛐舯帅如掣通譬呲啪咖咖。65432岂之掣避罾GBT 22969-2008附录B(资料性附录)回收率链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据牛奶样品 奶粉样品平均回收率 平均回收率添加浓度 添加浓度(ffgkg) 链霉索 双氢链霉素 卡那霉素 (弘gkg) 链霉素 双氢链霉素 卡那霉索50 973l 9635 9515 400 9178 9317 8932100 9588 9375 9866 800 9258 9419 915720 o 96 36 9486 9591 1600 9279 9278 934550 o 96 96 9480 95 56 4000 9043 93 61 8913
