1、ICS 67050X 04 a亘中华人民共和国国家标准GBT 22954-2008河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of streptomycin，dihydrostreptomycin andkanamycin residues in fugu and eelLCMs-MS method2008-12-31发布 2009050 1实施宰瞀徽紫瓣訾雠赞星发布中国国家标准化管理委员会捉111目U 罱本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归IZl。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检
2、疫局。本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、杨志伟、曹亚平、庞国芳。GBT 22954-2008河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22954-20081范围本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定。本标准方法的检出限：链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为100 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标
3、准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分；总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 5725一l：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理河豚鱼或鳗鱼试样中的抗生素用
4、磷酸溶液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，用苯磺酸型和羧酸型固相萃取柱净化。液相色谱一串联质谱仪(EsI+)检测，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为优级纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44甲酸。45浓磷酸。46磷酸氢二钾(KzHPO。)。47三氯乙酸(C：HCI。O：)。48庚烷磺酸钠(c7H，；NaO。SH：O)。49 5磷酸溶液(1+19)：取50 mL浓磷酸(45)，用水定容至1 L。410 02 molL磷酸盐缓冲溶液：pH=85。称取348 g磷酸氢二钾(46)用水溶解，定容至1 L，用氢氧化钠溶液调节pH=85。411 三氯乙酸溶液：5
5、0，质量分数。取20 g三氯乙酸(47)，用水定容至20 mL。412 001 molL庚烷磺酸钠溶液：称取220 g庚烷磺酸钠(48)，用水溶解，定容至1 L。】GBT 22954-2008413 SPE洗脱溶液：取4 mL甲酸(44)，用001 molL庚烷磺酸钠溶液(412)定容至i00 mL。414 25甲醇溶液(1+3)：取25 mL甲醇(42)，用水定容至100 mL。415标准物质：链霉素(CAS：381074一o)、双氢链霉素(CAS：128-461)和卡那霉素(CAS：2538994一o)；纯度均98。416 10 mgmL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素
6、标准物质(415)，分别用03乙酸水溶液溶解并配制成10 mgmL的标准储备溶液。避光保存于一18冰柜中。417 01 pgmL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液(416)，用03乙酸水稀释成01 pgmL的混合标准溶液，避光保存于一18冰柜中。418苯磺酸型固相萃取柱(500 mg，3 mL)或相当者。使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。419羧酸型固相萃取柱(500 mg，3 mL)或相当者。使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。420滤膜：02,um。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。52分析
7、天平：感量01 mg和001 g。53液体混匀器。54固相萃取装置。55均质器。56真空泵：真空度应达到80 kPa。57微量注射器：25 tzL，100 pL。58 pH计：测量精度士O02 pH单位。59具塞离心管：100 mL。510刻度离心管：5 mL。511贮液器：50mL。512离心机：转速4 000 rmin以上。6试样的制备与保存61试样的制备实验室样品混合均匀，分出05 kg作为试样。62试样保存试样置于一18冰柜，避光保存。7测定步骤71待测样品溶液的制备711样品提取和初净化称取河豚鱼或鳗鱼样品10 g(精确到001 g)，置于100 mL离心管中，加入30 mL 5磷酸
8、溶液(49)，均质3 min，并用5磷酸溶液清洗均质器刀头合并洗涤液，加入3 mL三氯乙酸溶液(4i1)涡旋混合后在4 000 rrain下离心10 min。上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱(418)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2 mLmin的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用5 mL 5磷酸溶液(49)和10 mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱(418)，弃去全部流出液。用20 mL磷酸盐缓冲溶液(410)洗脱至50 mL离心管中。GBT 22954-2008712样品溶液再净化上述洗脱液倒人下接羧酸型固相萃取柱(419)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2
9、mLmin的流速通过荦取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10 mL水和10 mL 25甲醇溶液(414)洗涤羧酸型固相萃取柱(419)，弃去全部流出液。减压抽干羧酸型固相萃取柱(419)30 rain。用z mL SPE洗脱液50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 土20 士25 土30 土50742定量测定外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。链霉素、双氢链霉素和
10、卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验不称取样品，其余均按试样步骤进行。77回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的残留量按式(1)计算：xciV船u u(1)m l U式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶
11、液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按GBT 63791和GBT 63792规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4。4GBT 22954-2008表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R链霉素 502000 19 r一1，1141lgm一1036 6 lgR一0908 0Igm一0，833 3双氢链霉素 5，020
12、00 IgRl 347 8lgm一1088】 lgR一1058 419mo-987 6卡那霉素 5O200 0 lg r一0867 0lgm一082l 4 lgR一0708 5 lg m一0604 7注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4，5GBT 22954-2008附录A(资料性附录)多反应监测(MRM)色谱图链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。逾12 OOO
13、捌譬9 0006 0003 000链霉素582263星25 000趔翅20 OOO蛋10 12 14 16双氢链霉素5842536 8 10 12 14 16卡那霉素485163O 2 4图A1 链霉素、双氨链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图0O0OOOOOOOO000O0OOO654321旨理目霉GBT 22954-2008附录B(资料性附录)回收率链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据添加浓度 平均回收率化合物名称(pgkg) 河豚鱼 鳗 鱼5o 9048 8961lOo 9121 9127链霉素20o 9567 904550o 94 35 92485o 98 17 913910o 9397 9371双氢链霉索20o 94 63 904550 o 9612 89465O 9308 904510 o 9269 9245卡那霉索20O 96 50 901550 o 9435 9046
