1、ICS 67050X 04 a园中华人民共和国国家标准GBT 22995-2008蜂蜜中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of streptomycin，dihydrostreptomycin andkanamycin residues in honey-LC-MS_MS method20081231发布 2009050 1实施丰瞀髁紫瓣警襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19刖 昌本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归1：3。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本标
2、准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、曹亚平、孙海侠、庞国芳。GBT 22995-2008蜂蜜中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22995-20081范围本标准规定了蜂蜜中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定。本标准的方法检出限：链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为50#gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方
3、研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，Is0 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，IS0 3696：1987，MOD)3原理蜂蜜试样中的抗生素用磷酸盐缓冲溶液提取，用Oasis HLB固相萃取柱
4、”和羧酸型固相萃取柱或相当者净化。液相色谱一串联质谱仪(ESI+)检测，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为优级纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44甲酸。45磷酸氢二钾，K。HPO；。46庚烷磺酸钠，Ct H。；NaO。SH20。47 02 molL磷酸盐缓冲溶液：pH=80。称取348 g磷酸氢二钾(45)，用水溶解，定容至1 L，用磷酸调节pH一80。48 001 molL庚烷磺酸钠溶液：称取220 g庚烷磺酸钠(46)，用水溶解，定容至1 L。49 SPE洗脱溶液：取4 mL甲酸(44)，用001 molL庚烷磺酸钠溶液(48)定容至
5、100 mL。410 20甲醇溶液(I+3)：取25mL甲醇(42)，用水定容至100mL。411标准物质：链霉素(CAS：3810-74一o)、双氢链霉素(CAS：128461)和卡那霉素(CAS：2538994一o)；纯度均大于等于98。1)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 22995-2008412 10 mgmL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质(411)，分别用03乙酸水溶液溶解并配制成10 mgmL的标准储
6、备溶液。避光保存于一18冰柜中。413 01 pgmL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液(412)，用03乙酸水溶液稀释成01 t-gmL的混合标准溶液，避光保存于一18冰柜中。414 Oasis HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL)或相当者：使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。415羧酸型固相萃取柱(500 mg，3 mL)或相当者：使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。416滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53液体混匀器。54固相
7、萃取装置。55均质器。56真空泵：真空度应达到80 kPa。57微量注射器：25 pL，i00 pL。58 pH计：测量精度士o02 pH单位。59三角瓶：200 mL。510贮液器：50mL。6试样的制备与保存61试样的制备实验室样品混合均匀，分出05 kg作为试样。62试样保存试样置于18冰柜，避光保存。7测定步骤71待测样品溶液的制备称取蜂蜜样品10 g(精确到001 g)，置于200 mL三角瓶中，加入20 mL 02 molL磷酸盐缓冲溶液(47)，涡旋混合5 min后，全部倒人下接Oasis HLB固相萃取柱(414)的贮液器中，此Oasis HLB固相萃取柱(414)下面用适配器
8、接羧酸型固相萃取柱(415)，在固相萃取装置上使样液以小于2 mLmin的流速依次通过Oasis HLB固相萃取柱(414)和羧酸型固相萃取柱(415)，待样液全部通过两支固相萃取柱后，依次用10 mL水和10 mL 20甲醇溶液(410)洗涤两支固相萃取柱，弃去全部流出液和Oasis HLB固相萃取柱(414)。减压抽干羧酸型固相萃取柱(415)30 min。用2 mLSPE洗脱液(49)洗脱至5 mL刻度离心管中，用SPE洗脱液(49)定容至20 mL，混匀后过02 tLm滤膜(416)，供液相色谱一串联质谱测定。72基质混合标准校准溶液的制备称取五个阴性蜂蜜样品10 g(精确到001 g
9、)，分别置于200 mL三角瓶加入适量混合标准溶液(413)，制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为25 pgkg、50 pgkg、100 pgkg、50o pgkg2GBT 22995-2008和1000#gkg的基质标准溶液。其余按71步骤操作完成。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：Atlantis C，8，35 pm，150mm21 mm(内径)或相当者；b)柱温：40；c)进样量：30 pL；d) 流动相：流动相A为01甲酸水溶液，流动相B为01甲酸乙腈溶液，流动相C为甲醇。梯度洗脱参考条件见表1。袁1 液相色谱梯度洗脱参考条件时间rain 流速(p
10、Lrain) 流动相A 流动相B 流动相C0 ZOO 85 10 53 01 200 60 35 5600 200 60 35 5601 200 85 10 51600 200 85 lO 5732质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d) 电喷雾电压(IS)：5 000 V；e)辅助气(Aux)流速：7 Lmin；f)辅助气温度(TEM)：550；g) 聚焦电压(FP)：150 V；h)链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2。表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数定性离子对 定量离子对 去簇电
11、压 采集时间 碰撞能量化合物名称 (mz) (mz)(DP)V (CE)V链霉素 582263 45582263 110 100(streptomycin) 582246 55双氢链霉素 584263 43584263 100 100(dihydrostreptomycin) 584246 55卡那霉素 485163 34485163 50 100(kanamycin) 485324 2374液相色谱一串联质谱测定741定性确证每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在士25之内；且样品谱图中各组分的相
12、对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定3GBT 22995-2008的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 l相对离子丰度K K50 20K50 i0K20 K10I允许最大偏差 土20 士25 士30 土50742定量测定外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。链霉素、双氢链霉素和卡那
13、霉素的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验不称取样品，其余均按试样步骤进行。77回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的测定按式(1)计算：xc筹揣式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c-一从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)V样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表最终试样的质量，单位
14、为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按GBT 63791和GBT 6379z规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化台物名称 舔加浓度范围 重复性限r 再现性限R链霉素 251000 lg r一1 313 019m一10831 19R=1169 9lg1 006 9双氢链霉素 2S1000 培r一1030 9培m一091Z 3 Ig置一11031lgm
15、一1013 2卡那霉素 251000 lg r=O935 4Igm一0947 5 lgR一1093 4tgm 1020 2注：m为两次测定结果的算术平均值。GBT 22995-2008如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 22995-2008附录A(资料性附录)多反应监测(MRM)色谱图链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。15 0006 0005 000a 4 ooo之毪3 000埋香2
16、0001 000O链霉囊30卡那霉素I zrain图A1 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱圈00000096*号掣趟罾00000000000O0000O00050505111*号掣趟菩GBT 22995-2008附录B(资料性附录)回收率链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据平均回收率添加浓度(卜gkg)链霉素 双氢链霉素 卡那霉素25 9556 9754 95】150 9638 92 22 966710o 9412 9135 944625o 9610 9435 95oo
