1、ICS 67050X 04 a亘中华人民共和国国家标准GBT 22982-2008牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of metronidazole，ronidazole，dimetridazole residuesin milk and milk powderLCMSMS method20081231发布 2009050 1实施宰瞀鹘鬻瓣警襻瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“1”刖 罱GBT 22982-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位
2、：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王风池、艾连峰、郭春海、段文仲、陈瑞春、吕红英、窦彩云、马育松、庞国芳。牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22982-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的高效液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定和确证。本标准的方法检出限：牛奶中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑为05 pgkg，羟基甲硝唑为1 pgkg，1一甲基一2一羟甲基一5一硝基咪唑为25 p
3、gkg；奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑为25 pgkg，羟基甲硝唑为5 pgkg，1一甲基一2一羟甲基一5一硝基咪唑为125 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的g【用而成鸯本标准的条款。凡是注置期的g用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正
4、确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理用乙腈一乙酸乙酯提取试样中的分析物，阳离子固相萃取柱净化，高效液相色谱一串联质谱测定，内标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为液相色谱纯，水为GBT 6682规定的一级水。41乙腈。42乙酸乙酯。43甲醇。44丙酮。45乙酸。46氨水。47无水硫酸钠，分析纯：经650灼烧4 h，置于干燥器内备用。48氨水一乙腈(1+19)：量取5 mL
5、氨水，用乙腈定容至100 mL。49标准品：甲硝唑(metronidazole，CAS：13182893)、洛硝哒唑(ronidazole，CAs：7681767)、二甲硝唑(dimetridazole，CAS：551928)、羟基甲硝唑(metronidazole-OH，CAS：7681767)、1-甲基2羟甲基5一硝基咪唑(hydroxydimetridazole，CAS：936-05一o)、氘代洛硝哒唑(RNzD3)、氘代羟基甲硝哒唑(MZNOHD2)和氘代1一甲基一2一羟甲基一5一硝基眯唑(HMMNID3)：纯度均大于等于98。1GBT 22982-2008410标准储备液：分别精确称
6、取适量标准品，用甲醇配制成100 pgmL的标准储备液。411混合标准中间工作液：取标准储备液各1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1 t*gmL。412内标标准储备溶液：称取适量氘代内标标准品，用甲醇溶解成浓度为200 pgmL储备液。413内标混合标准中间工作液：量取适量标准储备液(412)，用甲醇定配制成内标混合标准中间工作液，浓度为1 f*gmL。414滤膜：045 pm。415阳离子固相萃取柱：500 mg，3 mL，使用前依次用3 mL甲醇、3 mL乙酸乙酯活化。5仪器和设备5。1高效液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52离
7、心机。53分析天平：感量01 mg和001 g。54旋涡混和器。55旋转蒸发仪。56氮吹仪。57固相萃取装置。6试样的制备与保存61牛奶取均匀样品约250 g装人洁净容器作为试样，密封置4下保存，并标明标记。62奶粉取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。7测定步骤71提取牛奶样品称取5 g(准确至001 g)于50 mL具塞离心管中，奶粉样品称取1 g(准确至001 g)并加入5 mL水，往称取好的样品中加入25 pL 100 ngmL内标混合液，混匀。在称取好样品离心管中首先加入5 mL乙腈以沉淀蛋白，然后再加入20 mL乙酸乙酯，振荡提取2 min后，3 000 r
8、rain离心10 rain，移取上清液并通过5 g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中。再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。72净化将提取液于45下旋转蒸发至约2 mL左右，然后转移到已活化的固相萃取柱上，再用5 mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到固相萃取柱上，以小于2 mLmin流速滴下。接着依次用3 mL丙酮，3 mL甲醇，2 mL氨水一乙腈(5+95)淋洗，最后用5 mL氨水一乙腈(5+95)洗脱并收集(此过程流速小于2 mLmin)。洗脱液在45水浴上用氮气小心吹至近干，用水定容至1 mL，涡漩混合后，过045 pm滤膜供HPLC MS-MS分析。73空白基质溶液
9、的制备将取牛奶阴性样品5 g，奶粉阴性样品1 g(精确到001 g)，按71和72操作。74测定条件741液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：C18，5 pm，150 ram21 mm(内径)或相当者；2b)色谱柱温度：30；c) 进样量：15 pL；d) 流动相梯度及流速见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件GBT 22982-2008时间rain 流速(pLmin) 0 1乙酸水溶液 乙腈000 200 80 20600 200 65 35800 200 65 358 10 200 80 20lOO 200 80 20742质谱参考条件质谱参考条件如下：a) 离子化模式：电喷雾正离
10、子模式(ESI+)；b) 质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；c)鞘气压力：104 kPa；d)辅助气压力：138 kPa；e)正离子模式电喷雾电压(IS)：4 000 V；f)毛细管温度：320；g)源内诱导解离电压：10 V；h)Q1为04，Q3为07；i)碰撞气：高纯氩气；j)碰撞气压力：02 Pa；k)参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表z。表2被测物的参考保留时间、监测离子对和裂解能量化合物名称 保留时间rain 检测离子对(mz) 裂解能量eV1880412296 13羟基甲硝唑 3 741880412594 18158 06140014 121甲基2一羟甲基一5一硝基咪唑 48
11、2158 0611205 19172 09128 008 15甲硝唑 4791720918203 252010513998 12洛硝哒唑 5762010511100 1714207196o 3 16二甲硝唑 643142078103 29氘代羟基甲硝哒唑 3 74 1900512497 12氘代1一甲基一2一羟甲基一5一硝基眯唑 482 1610614300 13氘代洛硝哒唑 479 2040414300 118为定量离子对，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。3GBT 22982-2008743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子
12、，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 土20 土25 土30 507432定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合基质标准校准溶液进样，以被测物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，混合基质校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行
13、定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76回收率试验吸取适量混合标准工作溶液，用空白基质溶液稀释成所需浓度的标准校准溶液。阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率，回收率范围参见附录B中的表B1。8结果计算试样中分析物的残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：x一会毒n瓦sl筹揣 (1)式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c。基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样
14、溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；o试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；屯基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；v样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，被测物的添加浓度
15、范4GBT 22982-2008围及重复性方程见表4和表5。表4牛奶样品五种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R羟基甲硝唑 I10 剐o 225 9m一0176 4 R一0181 2m+004961一甲基2羟甲基5硝基眯唑 2 525 ig0 929 lg0 836 lgR一1009 lgm一0692甲硝唑 055 lg r一0 952 lg0 902 19R一0898 lgm一0680洛硝哒唑 055 19 T-0873lg0 670 lgR一0854 Igm 0 665二甲硝唑 O55 同0 200m_u0 054 8 R
16、一0193m+0035 6注：m为两次测定结果的算术平均值。表5奶粉样品五种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R羟基甲硝唑 550 Ig rI259 7Igm一1173 8 lgR-1054 0 lgm一0654 21一甲基一2一羟甲基5硝基咪唑 125125 r-0133优+1190 R一0 137 m+3694甲硝唑 2525 k r一103319m o811 Ig R一0 985 19 m一062Z洛硝哒唑 2525 lg r-0928 lg0 687 lgR一0924lgm一0553二甲硝唑 2525 lg r一113
17、3 lg0 916 lgR 098019 m_u0 562注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4和表5。5GBT 22982-2008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图标准物质多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。图A1 标准物质多反应监测(MRM)色谱图附录B(资料性附录)回收率五种分析物的添加浓度及其回收率范围数据，见表BI。表B1 五种分析物的添加浓度及其回收率范围数据GBT 22982-2
18、008牛奶 奶粉化合物名称添加浓度(pgkg) 回收率范围 添加浓度(pgkg) 回收率范围1 89o108 5 8321052 980110 10 874111羟基甲硝唑4 9l-0106 20 89910910 83 8105 50 80110105 82o102 25 828100l 90o110 5 918116甲硝唑2 855115 10 88 71055 948106 25 8l 510925 948108 125 9431091甲基一2一羟甲基一 5 982110 50 8241055硝基咪唑 10 921112 100 87011625 896106 125 94311105 820102 25 820105l 86 0110 5 896109洛硝哒唑2 910108 10 8189745 882103 25 8269730 5 82 O98 0 25 824104l 800970 5 844103二甲硝唑2 860101 10 8031035 948106 25 816107
