1、ICS 67050X 04 a国中华人民共和国国家标准GBT 22992-2008牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of zearalanol，zearalanone，diethylstilbestrol，hexestrol anddienoestrol multiresidues in milk and milk pOwde卜LCMSMS method2008-12-31发布 2009050 1实施丰瞀髁紫瓣警矬瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19刖 昂GBT 229922008本标准的附录A、附录B
2、为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：许泓、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳。牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2299220081范围本标准规定了牛奶和奶粉中玉米赤霉醇(zearalaa01)、玉米赤霉酮(zearaanone)、已烯雌酚(diethylsti|bestroD、己烷雌酚(hexestro)、双烯雌酚(dieno-estroD残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本
3、标准用于牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定。本标准方法检出限：牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为10 ILgL；奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为80 ttgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总
4、则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，IsO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理用乙腈作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取，阴离子固相萃取柱进行净化，用液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44氨水
5、。45甲酸。46氢氧化钠。47 5 molL氢氧化钠溶液：称取200 g氢氧化钠，用蒸馏水定容到1 L。48淋洗液：氨水一水(1+19)。49洗脱液：甲酸一甲醇(1+19)。410激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇(包括”玉米赤霉醇和玉米赤霉醇，各50)纯度大于等于97；玉米赤霉酮，纯度大于等于97；己烯雌酚，纯度大于等于99；己烷雌酚，纯度大于等于GBT 22992-200898；双烯雌酚，纯度大于等于98。411标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物质，用甲醇(42)配制成1 mgmL标准贮备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作
6、为标准工作溶液，保存于4冰箱中。412内标标准物质：a一玉米赤霉烯醇一4氘代，纯度大于等于99；己烯雌酚一8氘代，纯度大于等于98。413内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉烯醇一4氘代和己烯雌酚8氘代标准物质，用甲醇(42)分别配制成1 mgmL标准贮备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4冰箱中。414基质提取液：空白样品，除不加入标准工作溶液(411)和内标工作溶液(413)外，其他操作同711及712处理后得到的溶液。415基质标准工作溶液：将标准工作溶液(411)及内标工作溶液(413)混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液(414)溶解，涡旋30 S后即为基质标准工作溶
7、液。416 Oasis MAX阴离子固相萃取柱”或相当者：60 mg，3 mL。417滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱串联质谱联用仪：配有电喷雾电离源。52自动固相萃取仪或固相萃取装置。53氮气吹干仪。54涡旋振荡器。55离心机：转速大于3 500 rrain。56高速离心机：转速大于9 000 rrain，温度可控制在4。6试样的制备61牛奶取50 mL新鲜或解冻的牛奶混合均匀，3 500 rmin离心5 min，取下层。62奶粉取125 g奶粉于烧杯中，加适量3550水将其慢慢溶解，转移至100 mL容量瓶中，待冷却至室温，用水定容混匀。取50 mL，以3 500 rmin离心5 ra
8、in，取下层。7测定步骤71 混合基质标准校准溶液的制备711样品量取于50 mL离心管中，分别加入不同量混合标准工作溶液(411)，使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为25 ngmL、50 ngmL、10 ngmL、25 ngmL、50 ngmL。再分别加入适量内标标准工作溶液(413)，使其浓度均为10 ngmL，在氮吹仪上于40水浴中吹干。取5个阴性样品，每个样品为5 mL，置于上述离心管中涡旋混合后，加10 mL乙腈，涡旋混合3 min，3 500 rmin离心10 min，取上清液于离心管中，再向样品中加入5 mL乙腈，同前操作，合并提取液，50下
9、氮吹至体积小于01 mL。加水10 mL，用5 molL NaOH调节pH至110，4，21)OasisMAX阴离子固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GBT 22992-20089 000 rmin离心5 rain，备用。712提取净化固相萃取净化条件：先用2 mL甲醇、2 mL水将柱子活化，流速均为4 mLmin。将711样品上清液上柱，流速为1 mLmin，依次用l mL淋洗液(48)、05 mL甲醇以3 mLmin的速度淋洗，通入20 mL空气以4 mLmin的速度
10、吹过Oasis MAX柱。用4 mL洗脱液(49)洗脱，流速为1 mLmin，加入30 mL空气以6 mLmin的速度吹过Oasis MAX柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40水浴中吹干，加入1 mL流动相，涡旋30 s溶解。溶液过02 pm滤膜后，供液相色谱一串联质谱测定。72实测样品溶液的制备取待测样品5mL于50mL离心管中，加入适量内标标准工作溶液(413)，使其最终定容浓度均为10 ngmL。按711及712操作。7。3空白基质溶液的制备取阴性样品5 mL于50 mL离心管中，按711及712操作。74测定条件741液相色谱条件液相色谱条件如下：a) 色谱柱：ZORBAX Ecl
11、ipse SB C8，35zm，150 mm46 ram(内径)或相当者；b)柱温：25；c)流动相：乙腈一水(7+3)；d)流速：05 mLmin；e) 进样量：50 pL。742质谱条件质谱条件如下：a)离子化方式：电喷雾电离；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d)离子源温度：350；e)雾化气压力：0083 MPa；f)气帘气压力：0124 0 MPa；g)辅助气1压力：0275 6 MPa；h)辅助气2压力：024l 2 MPa；i)喷雾器电流：一5 pA；j)电喷雾电压：4 500 V；k) 定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压见表1。表1 5种激素
12、及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压化合物名称 定性离子对(m：) 定量离子对(mz) 碰撞能量v 去簇电压v32062772 一42 一110玉米赤霉酵3211Z77z32111610 40 10031871608 40 110玉米赤霉酮 3187160831871070一45 110玉米赤霉烯 32291599 50 9032291599醇4氘代 32291301 43 903GBT 22992-2008表1(续)化合物名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 碰撞能量V 去簇电压v2669251o 35 90己烯雌酚 266725102669237】 40 90264
13、72491 一36 80双烯雌酚 2647249I26472350 36 80269O1189 23 70己烷雌酚 2690134026901340 52 70275O2589 37 90已烯雌酚一8氘代 2750258 9275O2450 42 90743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在土25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表z规
14、定的范围，则可判定为样品中存在对应的待铡物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 l相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10l允许最大偏差 士20 土25 土30 土507432定量测定配制系列混合基质标准工作溶液(71)分别进样，绘制标准工作曲线。检查仪器性能，确定线性范围。用色谱数据工作站或选取与样品含量接近含有内标的标准工作液进行定量。样品溶液中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的响应值应在工作曲线范围内。标准品的液相色谱一串联质谱色谱图参见附录A中的图A1。本方法检测牛奶中的激素及代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试
15、验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8结果计算玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的测定按式(1)计算：X_cs瓦A乏象磊V器(1)式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；吒基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；As基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；c试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；c。；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；GBT 22992-2008A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积
16、；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。玉米赤霉醇和己烯雌酚将2种异构体面积或峰高值相加后以总量计算。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。9，2重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚在牛奶中的添加浓度范围及重复性方程见表3，在奶粉中的添加浓度范围及重复性方程见表4。表3 牛奶中的添加浓度范围及重复性和再现性方程
17、单位为微克每升化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R玉米赤霉醇 1 o10 19 r=0965 6 Ig m1089 7 IgR一0962 5 lg0 712 8玉米赤霉酮 1 010 lg r一09 66 0lgm1 144 5 lgR一0915 2 lgmO651 3己烯雌酚 1010 lg r一0984 419m一1093 5 IgR一0205 8 lgm+0011 9双烯雌酚 1010 19 r一0073 5 19 m+0001 6 19R-1 081 3 19m一0798 2己烷雌酚 1010 lg r一0976 0 lg m一1044 5 lgR一0925 2 Ig0 6
18、61 3注：m为两次测定结果的算术平均值。表4 奶粉中的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限， 再现性限R玉米赤霉醇 10100 ig r一0965 6 lgm1089 7 lgR=0962 5lgm一0712 8玉米赤霉酮 10100 lg r一0966 0lgm一1144 5 19R-0915 2 lgm一0651 3己烯雌酚 10100 lg r一0984 4lgm1093 5 lgR一0205 819m+0011 9双烯雌酚 10i00 Ig r-0073 5lg，n+0 00l 6 lgR一1081 3lg0 798 2己烷雌酚 101
19、00 ig r-0976 0lgm1 044 5 lgR一0925 2 Igm 0661 3注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚在牛奶中的添加浓度范围及再现性方程见表3，在奶粉中的添加浓度范围及再现性方程见表4。SGBT 22992-2008附录A(资料性附录)标准物质液相色谱一串联质谱图玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚标准物质液相色谱一串联质谱图，见图A1。Maxl 2。4。p5鼍
20、34c4 引i。矿。争粪0 s。岔5,98南。旆：。Maxl1e4 cpsi100c4 I鳖oocJim，。，s zsssam。a 5f。暑。5。Jc4 -譬!“ o 5 1-o l5 2 o 2 5 30 3 5 40 4 5 50 55 6 o 65 t o 7 5 o 85fm1；oiJ X-! 。05 10 15 2 0 25 30 35 40 45 50 &5 60 65 70 75 8 O&5tmm9。i“L。m川殳l l萱 。 。堕M战4 508 6 cps乳 蝈 譬6图A1玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚标准物质液相色谱一串联质谱图附录B(资料性附录)回收率GBT 22992-2008本方法检测牛奶中的激素及代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称 添加浓度(pgL) 平均回收率10 849320 8858玉米赤霉醇50 913510O 97801O 76102 0 7918玉米赤霉酮50 1010100 102410 80122 0 7867己烯雌酚50 1027100 963510 748320 9300双烯雌酚50 9953100 953210 91332 0 7267己烷雌酚50 9247100 1006
