1、ICS 11.220 B 41 远昌中华人民共和国国家标准GB/T 27621-2011 马鼻肺炎病毒PCR检测方法Protocol of PCR for equine rhinopneumonitis virus 2011-12-30发布2012-04-01实施数饲防伪/中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会发布剧吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:新疆农业大学。本标准主要起草人z冉多良、单文鲁、马伟、王传锋、张伟。GB/T 27621-
2、2011 I GB/T 27621-20门马鼻肺炎病毒PCR检测方法1 范围本标准规定了马鼻肺炎病毒的PCR检测方法。本标准适用于马匹的流通和进出境检疫实施马鼻肺炎的现场检疫和后续监管工作。一步法PCR检测技术适用于实验室细胞毒样品检测;巢式PCR检测技术适用于临床疑似样品及细胞毒样品检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件。EHV: equine rhinopneumonit
3、is，马传染性鼻肺炎。RNA: ribonucleic acid，核糖核酸。CPE: cytopathic effect，细胞病变。EB: ethidium bromide，澳化乙链。EDT A: ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胶四乙酸。SDS:sodium dodecyl sulfate，十二皖基磺酸铀。BHK-21: baby hamster kidney cell，仓鼠幼肾细胞。PBS: phosphate buffer sodium，磷酸盐缓冲液。4 试剂和材料(试剂不经注明，均为分析纯)4. 1 水:符合GB/T6682中一级水的规格。4.2
4、RNA酶A。4.3 酣-三氯甲烧。4.4 2%琼脂糖凝胶:见A.l。4.5 漠化乙链(10g/L):见A.204.6 DNA聚合酶(5U/L)。4. 7 50XTAE电泳缓冲液(pH8.5):见A.304.8 10 X PCR Buffer (pl us岛!Jg2+)。4.9 2.5 mmol/mL dNTP。4. 10 蛋白酶K(20mg/mL)。4. 11 BHK-21细胞。4. 12 含2%辑牛血清的MEM维持液。GB/T 27621-2011 4. 13 0.3 mol/L乙酸铀。4. 14 0.01 mol/L PBS缓冲液CpH7.2):见A.404.15 SDS。4.16 10X
5、TE缓冲液CpH8.0):见A.5。4.17 元水乙醇。4.18 70%乙醇。4. 19 Tris饱和酣CpH8.0)。4.20 分子质量标准DL2000。5 器材和设备5. 1 低温冷冻高速离心机。5.2 倒置显微镜。5.3 CO2恒温培养箱。5.4 普通冰箱和超低温冰箱。5.5 组织研磨器。5.6 1. 5 mL离心管。5.7 PCR扩增仪。5.8 水平电泳槽。5.9 微量移液器及吸头。5. 10 紫外照射仪或凝胶成像仪。6 EHV的分离6. 1 采样取马流产胎儿病料的肺、脾或淋巴组织，疑似病驹呼吸系统的鼻咽拭子3根。6.2 样晶处理组织样品2g与2mL O. 01 mol/L PBS缓冲
6、液置于组织研磨器中研磨匀浆，反复冻融3次;鼻咽拭子3根在2mL 0.01 mol/L PBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。6.3 病毒增殖将毒种接种到单层的BHK-21细胞上，37oC吸附1h，加适量含2%的棋牛血清的MEM维持液，CO2恒温培养箱37oC静置培养，利用倒置显微镜逐日观察CPE，48h后当CPE达85%以上时收毒，冻存于一70oC冰箱备用。7 EHV的PCR检测7. 1 样品处理组织样品2g与2mL o. 01 mol/L PBS缓冲破研磨匀浆，反复冻融3次;鼻咽拭子3根在2mL 0.01 mol/L PBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。GB/T 27621
7、-2011 7.2 核酸抽提取适当病料或细胞毒0.5mL，加入RNA酶A至终浓度为100g/mL，37oC作用30min;加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度为100g/mL，SDS终浓度为0.5%。在560C水浴内反应60min至反应物清亮，期间不断轻摇溶液。加等体积TE饱和醋，轻摇20min, 12 000 r/min离心7min;取水相加等体积酣-三氯甲:皖(1: 1)，轻摇20min, 12 000 r/min离心7min;取水相加等体积三氯甲烧，轻摇15 min, 12 000 r/min离心7min;收集水相。在上述水相中加入2.5倍体积预冷的元水乙醇和终浓度为0.3mol/L乙酸锅
8、，一200C放置20mino 12 000 r/min离心10min，使核酸沉淀，弃去上清液。立刻加入70%乙醇，将沉淀漂洗2次，以去除残留的盐类。倾去乙醇，倒置在滤纸上干燥，然后加0.5mL TE(pH 8.0)，于4oC冰箱内过夜溶解DNAo37 oC干燥20min或抽真空干燥;最后加10L水溶解后，作为PCR模板。7.3 以引物F、引物F1c和引物F4c(参见B.1)为条件的体系含1.5 mmol/L MgClz的10X PCR Buffer 5L;2.5 mmol/L的dNTP4L;引物F、引物F1c和引物F4c(参见B.1)各1L;模板DNA1L;DNA聚合酶0.5L;加双蒸水至50
9、L，然后将上述成分混合均匀。在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应条件为94oC预变性4min，30次如下循环:94 oC 1 min, 56 oC 1 min, 72 oC 1 min，最后72oC延伸7mino 取10LPCR扩增产物，加2L6X加样缓冲液，在含有澳化乙链的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000 Marker作分子质量标准比较:EHV-1会出现311bp的DNA片段，EHV-4会出现468bp的DNA片段。空白对照在311bp和468 bp没有核酸带(参见附录C)。7.4 巢式PCR扩增方法7.4. 1 以引物Fz和引
10、物Fc参见B.2a)为条件的体系如下:一含1.5 mmol/L Mg C12的10X PCR Buffer 5L;2.5 mmol/L的dNTP4L;51物Fz和引物Fc参见B.2a)各1L;模板DNA1L;2. 5U DNA聚合酶O.5L;加双蒸水至50L，混合均匀，瞬时离心后，放入PCR仪中。PCR反应程序为94oC预变性4min，25次循环(94oC变性1min, 51 oC退火1min, 72 oC延伸1min，最后72oC延伸7min) ，取出PCR反应产物;一二一取10LPCR扩增产物，加2L6X加样缓冲液，在含有澳化乙链的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，在紫外照射仪或凝胶成像仪
11、上观察产物荧光带位置，以DNA2000 Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1和EHV-4会出现747bp的DNA片段，空白对照在747bp没有DNA片段，参见图D.1)。7.4.2 巢式PCR第二次反应:待扩增病毒DNA为100倍稀释的一次扩增PCR产物作为二次扩增模板。以引物F1和引物F1c参见B.2b)为条件的体系如下:一一一含1.5 mmol/L MgC12的10XPCRBuffer 5L;2.5 mmol/L的dNTP4L;引物F1和引物F1c参见B.2b)各1L;模板DNA1L;2.5U DNA聚合酶0.5L;加双蒸水至50L。然后，将以上各成分混合均匀放入PCR仪中。PC
12、R反应条件为94oC预变性4min，25次循环(94 oC变性1min, 45 oC退火1min, 72 oC延伸1min，最后72oC延伸7min); 取10LPCR扩增产物，加2L6X加样缓冲液，在含有澳化乙链的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000 Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1出现404bp的DNA片段，空白对照在404bp没有DNA片段，参见图D.2)。3 GB/T 27621-2011 7.4.3 以引物F4和引物F4c参见B.2c)J为条件的体系如下:一一一含1.5 mmol/L MgClz的10X PCR
13、 Buffer 5L;2.5 mmol/L的dNTP4L;引物F4和引物F4c参见B.2c) 各1L;模板DNA1L;2. 5U DNA聚合酶O.5L;加双蒸水至50L，然后将以上各成分混合均匀放入PCR仪中。PCR反应程序为94.C预变性4min，25次循环(94 .C变性1min ,56 .C退火1min, 72 .C延伸1min，最后72.C延伸7min); 一取10LPCR扩增产物，加2L6X加样缓冲液，在含有澳化乙链的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000 Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1出现334bp的DNA片
14、段，空白对照在334bp没有DNA片段，参见图D.3)。7.4.4 以引物F和引物F1c、F4c参见且2d)为条件的体系如下:一一含1.5 mmol/L MgClz的10XPCRBuffer 5L;2.5 mmollL的dNTP4L;引物F、引物F1c和引物F4c参见B.2d)各1L;模板DNA1L;2. 5U DNA聚合酶0.5L;加双蒸水至50L，然后将以上各成分棍合均匀放入PCR仪中。反应程序为94c预变性4min，25次循环(94.C变性1min, 50 .C退火1min , 72 .C延伸1min，最后72c延伸1min); 一-取10LPCR扩增产物，加2L6X加样缓冲液，在含有澳
15、化乙链的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000 Marker作分子质量标准比较(在311bp位置上有核酸带，判定为EHV-1型阳性样品f在468bp位置上有核酸带，判定为EHV-4型阳性样品;在311bp和468bp位置上都有核酸带，可判为EHV-1和EHV-4型混合感染，参见图D.心。7.5 设立对照7.5.1 在7.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。7.5.2 取含有己知EHV的病毒标准株的组织悬液作为阳性对照。7.5.3 采用未接种病毒的正常BHK-21细胞抽提核酸作为阴性对照。7.5.4 取等体积
16、的水代替模板作为空白对照。7.6 琼脂糖电泳用TAE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含1g/mLEB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6LPCR扩增产物和2L澳酣蓝指示剂溶液混匀后加入孔内。在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h，当澳酣兰到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7.7 结果判定7.7. 1 一步法PCR扩增结果判定如下(以DNA2000 Marker作分子质量标准比较): a) EHV-1会出现311bp的DNA片段，EHV-4会出现468bp的DNA片段。空白对照在311 bp和468bp没有核酸带。对照成立才能进行判定。b) 在311bp
17、位置上有核酸带，判定为EHV-1型阳性样品;若在311bp位置上无核酸带，判定为EHV-1型阴性样品。在468bp位置上有核酸带，判定为EHV-4型阳性样品;若在468bp位置上元核酸带，判定为EHV-4型阴性样品。7.7.2 巢式PCR结果判定如下(以DNA2000 Marker作分子质量标准比较): 4 a) 一次PCR扩增结果=标准EHV-1/4会出现747bp的DNA片段。空白对照在747bp没有DNA片段。二次PCR扩增结果:标准EHV-1出现311bp或404bp的DNA片段。空白对照在311bp或404bp没有DNA片段。标准EHV-4出现334bp或468bp的DNA片段。空白
18、对照在334bp或468bp没有DNA片段。两次结果对照成立才能进行判定。GB/T 27621-2011 b) 若一次扩增后在747bp位置上有核酸带，判定为阳性样品;元核酸带或条带的大小不在747 bp位置上，判为阴性样品。若二次扩增后在311bp或404bp位置上有核酸带，判为EHV-l型阳性样品;元核酸带或条带的大小不在311bp或404bp位置上，判定为非EHV-l型阳性样品。若二次扩增后在334bp或468bp位置上有核酸带，判为EHV-4型阳性样品;元核酸带或条带大小不在334bp或468bp位置上，判为非EHV-4型阳性样品。若二次扩增后在311bp和468bp位置上有两条核酸带
19、，可判为EHV-lj4型混合感染。5 GB/T 27621-2011 附录A(规范性附录)试剂的配制A.1 2%琼脂糖凝胶琼脂糖2 g 1XTAE电泳缓冲液100 mL 微波炉中完全融化，待冷至500C时，加澳化乙链(EB)溶液5L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.2 漠化Z链(EB)溶液(10mg/mL) 澳化乙键灭菌双蒸水1 g 100 mL A.3 50 XTAE电泳缓冲液(pH8.5) 是基甲基氨基甲皖(Tris)EDTA.2H20 冰乙酸242 g 37.2 g 57.1 mL 灭菌双蒸水加至1000 mL，用时用灭菌双蒸水稀释使用。A. 4 O. 01 mol/L P
20、BS缓冲液(pH7.2) Na2 HP04 1. 42 g KH2P04 0.27 g NaCl 8g KCl 0.2g 灭菌双蒸水加至1000 mL，高压灭菌。A.510XTE缓冲液1 mol/L tris-HCl Buffer 100 mL O. 5 mol/L EDT A(pH 8.0) 20 mL 灭菌双蒸水加至1000 mL，高压灭菌。6 B.1 一步法PCR引物附录B(资料性附录)引物序到及其特性GB/T 27621-2011 引物合成参照GeneBank中的EHV-1和EHV-4的部分gB基因序列，用Primerpremier5.0软件设计特异性引物，其浓度为10pmol/mL，
21、序列如下:F: 5 GA TGCCA TGGAGGCACT ACAC3 F1c: 5 CTCGACTTTCTTCTCTCGGTCC3 , F4c: 5 TTGACACACAGTCGGTGAGT3 , B.2 巢氏PCR引物EHV-1和EHV-4共有EHV-l特有EHV-4特有引物合成参照GeneBank中的EHV-1和EHV-4的部分gB基因序列，用Primerpremier5.0软件设计特异性引物，其浓度为10pmol/mL，序列如下:a) 巢式PCR第一次反应的引物Fz: 5GGAAAGGATACAGCCATACGTC3 Fc: 5GTATATCGAGTCTATGGCTTC3 b) 巢式P
22、CR第二次反应扩增EHV寸的引物F1: 5 GAGGTGGAGCTTGA TTTGTG3 F1 c: 5 CTCG ACTTTCTTCTCTCGG TCC3 d 巢式PCR第二次反应扩增EHV-4的引物F4 , 5TCGGTCAGCTGCTCAGTTAG3 EHV-l和EHV-4共有EHVl和EHV-4共有EHV-1特有EHV-l特有EHV-4特有F4c: 5 TTGACACACAGTCGGTGAGT3 , EHV-4特有d) 巢式PCR第二次反应同时扩增EHV-l和EHV-4的引物F: 5 GATGCCATGGAGGCACTACAC3 , Fl c: 5 CTCG ACTTTCTTCTCTC
23、GG TCC3 F4c: 5 TTGACACACAGTCGGTGAGT3 , EHV-l和EHV-4共有EHV-1特有EHV-4特有7 G/T 27621-20门附录C(资料性附录)一步法PCR反应结果扣1-DNA岛1arker(DL2000); 468bp 311bp 1一一标准EHV-l和标准EHV-4混合DNA;2一一阴性对照z3标准EHV-4DNA; 4一标准EHV-lDNA。M 2 3 4 图C.1以F/F1c-F4c为引物的一步法PCR反应结果8 M-DNA MarkerCDL 2000); 1一一一标准EHV-DNA; 2一一-标准EHV-4DNA; 3一阴性对照。747 附录D
24、(资料性附录)巢式法PCR反应结果M 1 2 3 图D.1以Fz/Fc为引物的第一次PCR反应结果3 21M 404bp M-DNA MarkerCDL 2000); 1 标准EHV-DNA; 2 标准EHV-4DNA; 3 阴性对照。图D.2以F1/F1c为引物的套式PCR反应结果GB/T 27621-2011 9 GB/T 27621-2011 M一-DNAMarkerCDL 2000); 1一一标准EHV-4DNA; 2-一标准EHV-1DNA; 3 阴性对照。21M 图D.3以F4/F4c为引物的套式PCR反应结果311 M一DNAMarkerCDL 2000) ; 1 阴性对照;2一
25、一-标准EHV-1和标准EHV-4混合DNA;3一一标准EHV-4DNA; 4-一标准EHV-1DNA. 12M 3 4 图D.4以F/F1c-F4c为引物的套式PCR反应结果10 FFON-NhNH益。华人民共和国家标准马鼻肺炎病毒PCR栓测方法GB/T 27621-2011 国白9峰中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰开本880X12301/16 印张1字数21千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷* 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107这价t;号:155066. 1-44358 G8/T 27621-2011 打印H期:2012年3月29HF002A
