1、ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民ft ./、和国国家标准GB/T 28094-20门芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae CPatel et al. ) Robbs et al. 2011-12-30发布数码防伪/ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布GB/T 28094-20门目U1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会
2、(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:刘鹏、罗加凤、崔汝强、魏亚东、王金成、刘勇、赵立荣、黄国明。I GB/T 28094-2011 芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于芒果果实、苗木等植物材料中芒果细菌性黑斑病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1193 基因检验实验室技
3、术要求SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 芒果细菌性黑斑病菌基本信息中文名:芒果细菌性黑斑病菌。学名:Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae (Patel, Moniz &. Kulkarni 1948) Robbs , Ribeiro &. Kimura 19740 病害英文名:mango bacterial black spot o 属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonoda
4、ceae，黄单胞菌属Xanthomonas。病菌潜伏在病叶、病枝条、病果等组织内越冬，是主要的初侵染源。病菌借风雨、流水和接触传播，远距离传播主要是带菌苗木、接穗和果实等。芒果细菌性黑斑病菌的其他信息参见附录A。4 方法原理依据症状特征，以及该病菌的生物学特性、生理生化特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检测鉴定。5 仪器用具生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、恒温培养箱、离心机(12000r/min)、分光光度计、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、电子天平(感量0.0001 g)、恒温水浴锅、恒温光照培养箱、低温冰箱、微量可调加样器(10L、100L、200L、1000L)等。6 试剂和培养基
5、6. 1 试剂MgC12，dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGT凹，Taq酶，氧化酶试纸条，细菌微量生化鉴定管，引物G/T 28094-2011 Xgyrconpcr F1 , Xgyrconrpcr 1 , Xgyrconfsp 1等购自生物公司。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为灭菌双蒸水。6.2 培养基NA培养基，半选择性培养基NCTM3和KC见附录B。7 检疫鉴定方法及步骤7. 1 现场检瘟芒果种植园的病害调查或进出境芒果样品的现场检疫中，若芒果植株或果实病害症状表现与附录A中描述类似，取样带回实验室做进一步分离鉴定，取样方法和步骤参照SN/T21220 7.
6、2 病原菌分离选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用无菌水清洗三次。在培养皿中滴入几滴元菌水，将病组织放入无菌水中，并用灭菌玻棒研碎，10min后用接种环蘸取，在半选择性培养基NCTM3或KC平板上划线分离，做不少于3个平板。置于280C下，NCTM3培养基培养5d6 d，KC培养基培养4 d5 d后观察。Xcm在这两种培养基上菌落特征相似，直径3mm4 mm，圆形，轻微凸起，边缘整齐，白色或乳白色(少见黄色)，茹液状。挑取可疑单菌落点接在氧化酶试纸条上，选择60s内不变色的单菌落(排除假单胞菌在NA培养基上进行分离纯化。7.3 分子生物学鉴定(PCR方法)分子生物学检测中安全措施方面要求
7、按照SN/T1193。纯化后的菌株经280C培养24h后，制备模板DNA，扩增gyrB基因，用元菌双蒸水代替模板做空白对照，扩增目的片段大小约为700bpo PCR产物回收后测序，测序结果与GenBank数据库中的已知模式菌株序列进行比对，该检测方法见附录B。7.4 生化指标测定采用生化鉴定管对可疑菌株和芒果细菌性黑斑病菌标准菌株进行下列指标的检测，包括硝酸盐还原，七叶灵水解，尿酶产生，HzS产生，淀粉水解，明胶液化，阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和果糖发酵，口引噪产生，精氨酸双水解。Xcm生化指标检测结果应为硝酸盐还原阴性，七叶灵水解阳性，HzS产生阳性，淀粉水解阳性，明胶液化阳性，能从阿拉伯糖
8、、纤维二糖、半乳糖和果糖产酸，口引牒产生阴性，尿酶阴性，精氨酸双水解阴性。7.5 致病性测定针刺接种苗木在温室或田间进行，离体叶片法接种在室内平皿保湿进行。取在NA培养基上培养24 h的菌株用无菌水配成约为108CFU/mL的菌悬液接种。用元菌水作阴性对照，芒果细菌性黑斑病菌标准菌株作用性对照。接种后的苗木保持湿度90%;离体叶片置培养皿中，叶柄用浸有50X 10 6 6-:!音氨基瞟岭(6-BA)培养液的脱脂棉保湿。温度白天30oC，晚上26oC，光照12h。接种9d后观察是否出现水渍状病斑。2 . GB/T 28094-2011 8 结果判定分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下三个方面的检测
9、结果，则可以判定检出Xcmod 在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符zb) 生理生化测定结果与描述相符;c) PCR扩增产物测序结果与已知Xcm的gyrB基因同源性在98%以上;或致病性测定表现典型症状。9 样品保存检出Xcm的样品至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁;保存期满后，需经灭菌后方可处理。10 菌种保存分离并最终鉴定为Xcm的商株应转接到NA培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于40C低温冰箱中保存，30d60 d转接一次，以防止病菌死亡，以备复核、谈判和仲裁。必要时将菌株用真空冷冻干燥机冻干后长期保存。3 GB/T 28094-20门附录A(资料性附录)芒果细菌性黑斑病菌其
10、他信息A.l 分布巴西、南非、苏丹、埃及、巴拉圭、多米尼加、马拉维、墨西哥、刚果、莫桑比克、法属圭亚那、索马里、摩洛哥、印度、巴基斯坦、澳大利亚、马来西亚、日本、中国(台湾、广东、海南)。A.2 寄主范围芒果(Mangiferaindica)、腰果(Anacardiumoccidentale)、巴西胡椒(5chinusterebenthifolius)、加椰芒果(5pondiascytherea)、槟椰青(5pondiasmombin)等漆树科植物。人工接种也可以侵染野芒果(5ondias mangifera)和紫葳科(Bignoniachamberlaynii)植物等。A.3 危害芒果细菌性
11、黑斑病主要危害芒果叶片、枝条、花芽、花和果实。感病叶片开始时呈水渍状斑，后扩展为褐色至黑色的多角形病斑，表面隆起，周围常有黄晕，大小约1mm3 mm，病斑边缘常受叶脉限制，有时多个病斑融合成较大的病斑，老病斑最后转为灰白色。枝条和花穗发病呈黑褐色溃殇斑，有些病斑开裂，伴有胶蒙古汁液渗出;果实上病斑呈水渍状小点，直径1mm1. 5 mm，常有胶粘汁液流出，后扩大成黑褐色，表面隆起，溃癌开裂。嫩茎感染后明显褪绿，并纵向开裂，渗出胶液变成黑斑。各部位病组织作显微镜检查，有大量细菌溢出。A.4 生物学特性病原菌在NCTM3和KC培养基上菌落特征相似，培养6d后菌落直径3mm4 mm，圆形，轻微凸起，边
12、缘整齐，白色或乳白色(少见黄色)，蒙古液状。在营养琼脂(NA)培养基上菌落圆形，白色至乳白色，也有黄色。在KB培养平板上，菌落为薄圆型，轻微凸起，边缘整齐。菌落颜色最初为灰白色，逐渐变为白色到乳白色。老龄商落逐渐变为浅黄褐色。不产生荧光。病原菌菌体杆状，(0.3m0.6m)X(0.9m1.6m)，极生单鞭毛，革兰氏染色阴性，运动，好氧，葡萄糖氧化非发酵型，氧化酶阴性，接触酶阳性，淀粉水解阳性，明肢液化阳性，牛奶解阮阳性，硝酸盐还原阴性，HzS产生阳性，呵|睐产生阴性，尿酶阴性，脂肪酶阳性，纤维素酶阳性，酷蛋白酶阳性，果聚糖阳性，精氨酸双水解阴性，七叶灵水解阳性;能从阿拉伯糖、甘露糖、果糖、纤维
13、二糖、半乳糖和海藻糖产酸。可利用D-葡萄糖，纤维二糖，麦芽糖，D-甘露醇，D-甘露糖，赤薛糖醇，棉籽糖，L-鼠李糖，D-核糖，蔚糖，海藻糖，D-木糖，卫矛醇，D-半乳糖，肌醇，菊粉，甘油，醋酸盐，拧棱酸盐，延胡索酸盐，苹果酸盐，水杨昔，淀粉;不利用D-葡萄糖醇，D-葡糖酸盐，松三糖，草酸盐，苯丙氨酸，核糖醇，酒石酸盐。对部分重金属和抗生素敏感，在番茄上产生过敏性反应，最适生长温度28.C，37.C能生长，41.C不生长。芒果细菌性黑斑病菌与相近种的主要区别见表A.1。4 . GB/T 28094-2011 表A.1芒果细菌性黑斑病菌与相近种的主要区别芒果细菌性黑斑病菌地毯黄单胞菌草莓黄单胞菌自
14、纹黄单胞菌白杨黄单胞菌试验x. campestris pv. X. axonodis X.figaie X. albilineans X.。ulimangifeaeindicae 菌落粘液状(15%葡萄糖NA)+ + + 明胶液化+ + V 七叶背水解十+ + 牛乳蛋白降解+ + 从蛋白陈产H，S十十阿拉伯糖+ 甘露糖+ + + + 果糖+ 十十产酸纤维二糖+ 海藻糖+ + + 半乳糖+ V + 注:+一一):90%菌株为阳性;一二三90%菌株为阴性;V菌株间不稳定的反应。5 GB/T 28094-2011 附录B(规范性附录)培养基配制和PCR检测方法B. 1 培养基B. 1. 1 NCTM
15、3培养基酵母粉7g，蛋白陈7g，葡萄糖7g，琼脂15g，蒸锢水1000 mL, pH7.2 0 1210C湿热灭菌20min 后，温度降至500C左右，依次加人新霉素1mg/L，头抱氨书100mg/L，甲氧韦氨唔陡5mg/L，匹美西林100mg/L，丙环瞠20mg/L。B.1.2 KC培养基酵母粉7g，蛋白陈7g，葡萄糖7g，琼脂15g，蒸锢水1000 mL, pH7. 20 121 oC湿热灭菌20min 后，温度降至500C左右，依次加人头抱氨节40mg/L，春雷霉素20mg/L，丙环瞠20mg/L。B. 1. 3 NA培养基蛋白陈5g，牛肉浸背3g，琼脂15g，蒸锢水1000mLo 12
16、10C湿热灭菌20min。B.2 分子生物学鉴定方法(PCR方法)B. 2.1 DNA制备纯化后的菌株经280C培养24h后，用接种环取一环菌于含1mL元菌双蒸水的离心管中，用分光光度计调节A650=0.1，然后将该菌悬液1000C水浴煮沸8min，一200C放置10min后待用。B.2.2 gyrB基因扩增PCR扩增gyrB基因，引物为XgyrconpcrF1(5-AAGAGCGAGCTGTATCTGAAGGACGA-3 ) , Xgyrconrpcr1 (5 -CGCGTCCTCGATGCGCACCTGCA -3)。反应体系为(50L):10 X PCR缓冲液(含MgC12)5L，dNTP
17、s(各2.5 mmol/L) ，1L;引物(10pmol/f1L)各1L;TaqDNA聚合酶0.4L;DNA2Lo用元菌双蒸水代替模板做空白对照。反应条件为940C预变性5min;94 oC 40 s , 50 oC 50 s , 72 oC 1 min，共32个循环;720C延伸7mino B. 2. 3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增产物片段大小约为700bp。每个样品取5L的PCR产物加1L的6X上样缓冲液，在120V下电泳(约50min)。电泳结束后，放入装有O.5g/f1L的澳化乙链(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照并
18、保存。B. 2. 4 测序将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序(测序可由生物公司完成)。测序引物为Xgyrconfsp1 (5 -GAGCTGT ATCTGAAGGACGA-3)。测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对。6 FFON|叮moNH阁。华人民共和国家标准芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法GB/T 28094-2011 国由* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室，(010)64275323发行中心，(010)51780235读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤印张O.75 字数13千字2012年4月第一次印刷开本880X1230 1/16 2012年4月第一版4峰16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号，155066. 1-44648定价GB/T 28094-2011 打印H其H:2012年4月26flF002A
