1、SB中华人民共和国水产行业标准鱼类细菌病检疫技术规程20061206发布 2007-0201实施中华人民共和国农业部发布目 录第1部分：通用技术第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法第3部分：嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病诊断方法第4部分：荧光假单胞藏赤皮病诊断方法第5部分：白皮假单胞菌白皮病诊断方法115253139ICS 6502030B 41S B中华人民共和国水产行业标准SCT 720112006鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术Rules for quarantining bacterial diseases of fishPart 1：General technique200
2、61206发布 20070201实施中华人民共和国农业部发布前 言NCT 7201，12006SCT 7201鱼类细菌病检疫技术规程分为五个部分：第1部分：通用技术；第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法；第3部分：嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病诊断方法；第4部分：荧光假单胞菌赤皮病诊断方法；第5部分：白皮假单胞菌白皮病诊断方法。本部分为sCT 7201的第1部分。本部分的附录A和附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、中国水产科学研究院珠江水产研究所。本部分主要起草人：何力、邹为民、徐
3、忠法、姜兰、周瑞琼、罗晓松。31范围鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术SCT 720112006本部分规定了鱼类细菌病检疫的常用试剂、培养基、器械设备、检验的常用方法以及结果的判定。本部分适用于鱼类细菌病的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注El期的引用文件，其最新版本适用于本部分。aBT 4789281994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GBT 18652-2002致病性嗜水气单
4、胞菌检验方法SCT 70142006水生动物检疫实验技术规范3常用试剂和培养基3常用试剂除非另有说明，在检验中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水。311醋酸铅(或三氯化铁)：用于硫化氢试验。312柠檬酸铵铁：用于七叶苷(esculin)水解试验。31 3酪氨酸：用于酪氨酸水解试验。3，1 4二氯化汞：用于明胶液化试验。31 5几丁质：用于几丁质分解试验。3，16七叶苷：用于七叶苷水解试验。317可溶性淀粉：用于淀粉水解试验。3。1。8脱脂奶粉：用于酪素水解试验。319过氧化氢：用于过氧化氢酶试验。3110碘液：用于淀粉水解试验。31” 明胶：用于明胶液化试验。3112葡萄糖：用于葡萄糖
5、利用试验。3113乙醚：用于靛基质试验。3。114溴麝香草酚蓝：用于葡萄糖利用试验。3115 vP试剂。3116吲哚试剂。3117格里斯氏(Oriess)试剂：用于硝酸盐还原试验。3118革兰氏染色液。3119 Kovacs试剂：用于靛基质试验。5SCT 7201120063120鞭毛染色剂。3121微量或常量糖发酵试剂管(葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、水杨苷)。常用试剂与染色液的配制见附录A。细菌生化鉴定管可代替相应的生化试验培养基和试剂。32培养基321昔通营养琼脂培养基按GBT 478928一1994中的47执行。322 Rimler-Shotts培养基按GBT 18652-2002附
6、录A中的A3执行。3，23胰胨琼脂(qt0岬ngar)培养基见附录B中的B。1。32，4鉴别用培养基见附录B中的B2B12。4器械设备41常用仪器41 1超净工作台。412显微镜(10倍x100倍)。413双筒解剖镜。41 4离心机(RCF 10000g30 000g)。415恒温培养箱。416高压灭菌锅。417冰箱。418普通天平(相对精度11 000，分度值01 gO01 g)。419生化培养箱。4110电位pI-I计。4111烘箱。4112恒温水浴锅。4113匀质器或乳钵。4114全自动细菌鉴定仪。41 15细菌生化鉴定管。42常用用具421骨剪。422直头解剖剪刀。423眼科手术小剪刀
7、。424(直头、弯头)小镊子。425直头粗镊子。4 26解剖刀。427接种针(环)。43常用器皿4 3，1 白搪瓷解剖盘(桶、脸盆)。6SCT 7201卜一2006432培养皿。4 3 3试管。4 34酒精灯。435三角烧瓶：500 mL、250 mL。4 36载(盖)玻片。4 37广口瓶：500 mL。4 38玻璃量筒439铅皮标本箱。5采样方法按SCT 7014-2006第4章的规定执行。6临床诊断61活动情况观察病鱼鱼体的摄食情况、行为特点等。6 2外部检查观察病鱼鱼体的体色。将病鱼放在白色的搪瓷盘中，记录下病鱼的种类、年龄、全长、体长、体高和体重。检查鱼体体表的各部位(包括眼睛、鼻孔、
8、吻、鳍条、口腔、鳃丝等)，观察其充血、溃烂、发炎、黏液情况；皮肤粗糙、溃烂情况；鳞片、鳍条、腹部肿大、肛门肿胀情况；病鱼是否畸形等。63制片镜检用弯头镊子(或解剖刀)刮取病变或异常部位黏液(或取其一部分组织)放在预先已滴有洁净水滴的载玻片上，盖上盖玻片，镜检。64解剖检查将鱼的体壁剪去一面，观察是否有腹水；消化道内食物情况，肠内壁黏液、充血、发炎情况；按病症分别检查肝、脾、肾、心等器官。7实验室诊断71取样将检验个体以活体或用无菌操作采下病变组织，迅速放入密闭的无菌容器，低温运送到实验室。体表病灶明显的个体，用刀片刮去表面腐烂部分后，用接种环(针)在病灶处无菌取材进行病原菌分离；无明显体表病灶
9、的个体，应无菌取心血、肝、脾、肾等器官，无菌条件下操作，将样品捣碎，加无菌生理盐水或无菌水，匀浆后进行病原菌分离。7 2病原体分离与鉴定7 2 1培养基除特殊要求外，一般选用普通营养琼脂培养基。7 22分离方法按71的规定用无菌接种环在病灶处取样，在培养基平板上划线。可采用各种不同的常规划线方法，需尽量使其产生单个分散的菌落。在28-30培养24 h。7 23纯培养用无菌接种环挑取单个菌落，接种到普通营养琼脂培养基斜面试管上，在28-30*(；培养24 h。7 3鉴定方法7SCT 7201卜_2006731生化鉴定法根据细菌在代谢过程中所产生的合成或分解产物的不同，应用生物化学方法检测细菌的代
10、谢产物，从而鉴定细菌的种、属的技术。多采用细菌生化鉴定管进行试验，也可利用全自动细菌鉴定仪鉴定。732免疫学检测法利用抗原抗体的特异性免疫反应来检测病原体。包括免疫荧光检验、酶联免疫吸附检验和免疫(或转移印迹)实验等。免疫荧光技术检验见SCT 7014-2006的7131；酶联免疫吸附检验见SCT7014-2006的7132。733核酸检测法通过分析病原体的核酸分子来检测病原体。包括核酸杂交、特定基因片断的PCR、DNA指纹和16SrRNA等技术检测。8细菌致病性实验81条件在分离培养基上菌落类型很多，而且分不清主次，需重新分离细菌，并且应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种鱼体，测试其致病
11、性。82感染对象应选择与被检样品同龄、同规格的健康鱼类(血清检测阴性)。83感染方法用无菌生理盐水或蒸馏水稀释菌落，制成菌悬液，采用肌肉(或腹腔)注射、涂抹、浸泡的感染方式。观察24 h168 h实验鱼的反应。84感染结果出现与自然发病鱼症状相同的菌落为致病菌菌落。9结果判定8符合以下所有特征者，可判为相应的鱼病：a)有明显症状者，其表现符合临床检验的要求；b)鉴定的病原菌的种、属符合其相应病原菌类别；e)或鉴定后的病原菌的致病性实验，鱼体症状符合I临床检验的要求。附录A(规范性附录)试剂的配制方法SCT 720112006A 1革兰氏染色液按GB 4789281994中22的规定。A2格里斯
12、氏(Griess)试剂A 21 A液： 对氨基苯磺酸05 g10的醋酸 150 mL先用10的醋酸lO mL溶解对氨基苯磺酸，然后再加至150 mL。410C保存。A22 B液： a一萘胺01 g蒸馏水 20mL10醋酸 150mL稍加热溶解，用脱脂棉过滤，放棕色瓶中。4C10(3保存。A 3 kovacs试剂戊醇或异戊醇 150 n1L对二甲基苯甲醛 10 g浓盐酸 50mLA4鞭毛染色剂按GB 4789281994中27的规定。A5微量或常量糖发酵试剂管按GBT 18652-2002附录B中B5的规定。9SCT 720112006B 1胰胨琼脂培养基B11配方胰蛋白胨(Tryptone)牛
13、肉膏酵母膏醋酸钠琼脂粉水B 1，2配制附录B(规范性附录)培养基配方0，5905905 g0291591 000mL混匀，加热使之完全溶解，用1molL的NaOH调节pH，使灭菌后为7，274。分装烧瓶，12l高压灭菌15 rain。41210备用。B2明胶琼脂(Gelatin Agar)B21配方蛋白胨 15 g牛肉浸粉 3 g磷酸氢二钠(Na2I-II：D412H20) 2 g氯化钠 3 g明胶 10 g琼脂 13 g水 1 000mLB22配制混匀，加热使之完全溶解，用1 molL的HCL调节pH，使灭菌后为6401。分装试管，116(3高压灭菌15 rain，制成高层4C10*C备用。
14、B3氏枸橼酸培养基Chrlstensen】B31配方酵母浸粉0，5 g盐酸半胱氨酸01 g枸辣酸钠04 g氯化钠 5 g磷酸三氢钾 1 g蔼萄糖029酚红0012 g10SCT 7201 12006琼脂 约139水 1 000mLB32配制除酚红外，各成分加于水中，加热溶解，用1 molL的NaOH或HCL调节pH，使灭菌后为6569，加入酚红，分装试管，116高压灭菌15 min，制成斜面。B4硝酸盐液体培养基B4 1配方肉汁胨培养液 1 000mL硝酸钾 1 gB42配制用1molL的NaOH调节pH，使灭菌后为7076。每管分装4 mL5 mL，121(3蒸汽灭菌15 min20 min
15、。B5蛋白胨葡萄糖磷酸盐培养基B5 1配方蛋白胨葡萄糖磷酸氢二钾B52配制5 g5959调节pH，使灭菌后为72-74。每管分装4 mL-5 mL，115(2灭菌30 min。B 6休和利夫森二氏(HughLeifson)培养基B6 1配方蛋白胨 2 g氯化钠 5 g磷酸氢二钾02 g葡萄糖 10 g1溴百里酚蓝(溴麝香草酚蓝)水溶液 3 mL水 1 000mLB62配制除1溴百里酚蓝外，各成分加于水中，加热溶解，调节pH，使灭菌后为7072，加入1溴百里酚蓝，分装于试管，每管约3 mL，并在培养基内倒置1个Durham发酵管，116高压灭菌10min。B6，3 1溴百里酚蓝(溴麝香草酚蓝)水
16、溶液的制备先用少量95酒精溶解后，再加水配成1的溶液。B7酪蛋白琼脂(Casein Agar)B7 1配方琼脂 13 g脱脂牛乳 50mL水 1 000mL1】SCT 720112006B72配制混匀各成分，缓慢加热至沸腾，分装容器，121(2高压灭菌15 min，倾注无菌平皿备用。B 8溴甲酚紫淀粉琼脂(Starch Agar with Bromcresol Purple BCP淀粉琼脂)B81配方蛋白胨 109玉米淀粉 10 g02澳甲酚紫溶液 10 mL琼脂 13 g水 1 000mLB82配制各成分加入水中，加热溶解，调节pH，使灭菌后为7201。分装容器，11612高压灭菌15min
17、，制成斜面或平板备用。B，9七叶苷培养基(Aesculin Mediu m)B91配方05的胰蛋白胨培养基七叶苷柠檬酸铁B92配制1 000mL1 g05 g混匀各成分，加热溶解，分装小管，121高压灭菌20min。B 10酪氨酸琼H旨(Tyroslne Agar)B101配方普通营养琼脂 1 000 rrLL酪氨酸 5 gB102配制调节pH，使灭菌后为6872。将酪氨酸加入已溶化的琼脂培养基中，混匀，11612高压蒸汽灭菌15 rain，冷至50，缓慢充分摇匀，使酪氨酸分布均匀，制成平板。4C10备用。B，11 FWA培养基B”1配方硫酸镁005 g牛肉膏 2509磷酸氢二钾029葡萄糖 10 g蛋白胨 50 g酵母膏 259琼脂 10 g水 1 000 mLB112配制调节pH，使灭菌后为7274。121高压灭菌25 rain-30 rain。将琼脂添加量提高到15 g，即为12固体培养基。410备用。SCT 7201卜一200613
