1、, ; 回、二i田二川队:Ej .，-m州、EEa回国FJ-ri国飞;国中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1129-2007 代替S:-.r/T1129.11129. 22002 牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范Quarantine protocol for bovine viral diarrhea/mucosal disease 2007-08-06发布2008-03-01实施冉冉一市中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局SN/T 1129-2007 .u. 目IJ1=1 本标准代替SN/T1129. 1-2002(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程和SN/T 1
2、129.2-2002(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒分离操作规程。本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位.中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人=孙颖杰、张伯强、白泉阳、张体银、袁文泽、简中友、董志珍、霍营。本标准所代替标准的历次版本发布情况为2一一SN/T1129.1-2002; 一一SN/T1129.2-2002。I S.II/T 1129-2007 牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范1 范围本标准规定了牛病毒性腹泻检疫规范。本标准适用于牛病毒性腹泻的病毒分
3、离鉴定、病毒抗原检测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 疾病概述牛病毒性腹泻(bovineviral diarr1 ea , BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovineviral diarrhea virus, BVDV)引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，
4、可导致怀孕母牛的流产、死胎、致畸或新生较牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。粘膜病(MucosalDisease，MD)也是由BVDV引起的一种以牛的急性型口腔、消化道粘膜发炎、康烂、溃殇为特征的传染病。它和牛病毒性腹泻是同一病原引起，但表现不同的临床症状，发病动物口腔，特别是沿齿跟边沿康烂，还可出现流泪和大量流涎。该病传染性不高，临床症状明显，发病率低，而死亡率很高。其病原、流行病学、症状、发病机理和病理变化、检疫及诊断参见附录Ao4 检疫方法4. 1 病毒分离和鉴定4. 1. 1 仪器试剂4. 1. 1. 1 倒置荧光显微镜。4. 1.1. 2 二氧化碳培
5、养箱。4. 1. 1. 3 10 mL标准细胞培养瓶，24孔平底细胞培养板，带盖湿盒。4. 1. 1. 4 元BVD抗体胎牛血清，细胞分散液。4. 1. 1. 5 BVD标准毒株COregonC24或NADL)和标准阳性血清，BVD荧光抗体，BVD酶标抗体。4. 1. 1. 6 细胞z使用MDBK细胞或三代以内未感染BVD病毒的胎牛肾细胞CBK)。4. 1. 1. 7 溶液及细胞培养液:配制参见附录Bo4. 1. 2 样品的采集4. 1. 2.1 对于牛群、种牛的检疫，应元菌采集血液或者精液。4. 1. 2. 2 对于怀疑为死于病毒性腹泻的牛，应采集血凝块和肠系膜淋巳结。4. 1. 2. 3
6、对于流产、死胎牛的检疫，应采集胎儿的组织。4. 1. 3 样品的处理4. 1. 3. 1 血液用常规方法分离血洁，血凝块应冻融3次后，取析出的上清液。4. 1. 3. 2 精液冻融3次(或超声波裂解)后，按规定稀释，离心取上清液。4. 1.3.3 动物组织加10倍体积含有1000 IU/mL双抗的细胞培养液研磨，离心取上清液。SN/T 1129-2007 4. 1. 4 样晶的培养4. 1. 4. 1 取生长良好，形成80%以上单层的MDBK细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种1 mL，每个样品接种3个细胞瓶，同时直接接种样品稀释液作为阴性对照。4. 1. 4. 2 置37C二氧化碳培
7、养箱吸附30min-60 mino 4. 1. 4. 3 倒去样品，加入维持液，37:二氧化碳培养箱培养6d。4. 1. 4. 4 收获病毒，同一样品3瓶混合，放至20:冻融3次后进行下一步鉴定。4. 1. 5 荧光抗体法鉴定4. 1. 5. 1 将生长良好的细胞.用细胞分散液处理后，制备成2X105个/mL的细胞悬液，加入24孔细胞培养板内，每孔0.8mL.置37C培养.4. 1. 5. 2 待细胞生长成80%的单层，吸出孔内培养液.接种样品培养物，每孔400L.每个样品4个孔。阴性、阳性和空白细胞对照班怯同特拉样品检再切。4. 1. 5. 3 置37C二氧化碳培养桥自吸附30min-60
8、min。4. 1. 5. 4 吸出各孔内所加的待脸和对照样品，加入维持液，每于Lo.ll mL.置37:二氧化碳培养箱培养3 d , -干-一卢一.二/4. 1. 5. 5 弃掉24孔培养板内的培养液，用略核盐缓冲i部j;BSl漂洗自然干燥后，用20:丙酣固定15 min，用PBS洗3次，自然干燥。./;/ 4. 1. 5. 6 取固定好的24孔培养板.1主检样品及i岗位、阳性和空白细胞对照孔分别加入BVD阳性血清各2孔，每孔400L.l137&用Ltl . - :;: 4. 1. 5.7 弃掠板孔内的BVDl性血清，在所有板孔内加入工作浓量的BVD荧光抗体400L.放进湿盒.37C作用2人4
9、. 1.5.8 用PBS洗3次，倾去4. 1.5.9 镜检。BVD标抗体400L.放进湿盒.37:作用1h, 4. 1. 6. 2 弃去板中液体，用洗液洗板3次，每次1min-3 min，最后在吸水纸上轻轻拍干。4. 1. 6. 3 每孔加入显色/底物溶液400pL.封板于室温(8:-24 C l下感作30mino 4. 1. 6. 4 弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.1.6.2，再用兰蒸水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。4. 1. 6. 5 结果判定与解释将24孔板置于倒置显微镜判i费。阳性对照在显微镜下细胞浆(可能仅见于部分细胞)出现弥漫状或团块状棕红色着染，阴性对照、空白对照无
10、棕红色着染。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔出现棕红色着染，而经过阳性抗体抑制的同一样品无棕红色着染，则判为阳性。如果对照不成立，贝tl试验失败，重新检测。2 4.2 微量血清中和试验4.2. 1 仪器试剂4.2. 1. 1 溶液及细胞培养液参见附录Bo4.2. 1. 2 BVD标准毒株(regonC或NADL)和标准阳性、阴性血洁。4.2. 1. 3 细胞z使用MDBK细胞或三代以内未感染BVD病毒的胎牛肾细胞(BK)0 SN/T 1129-2007 4.2. 1. 4 被检血清z无商自牛静脉采血，分离血清编号后备用。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过56:、30min灭ii5处
11、理。4.2. 1. 5 元BVD抗体胎牛血泊，细胞分散液。4.2. 1. 6 50 mL标准细胞培养瓶，96孔无茵细胞培养板，50川，、100L微量可调移液器。4.2. 1. 7 倒置光学显微镜。4.2. 1. 8 二氧化碳培养箱。4.2.2 种毒的冒出l备4.2.4.7 以上对照和被检样品iI370C温箱中作用1h后，每孔加入3X10个/mL细胞悬液100I止，置37:二氧化碳培养箱培养。4.2.5 结果判定在37:二氧化碳培养衍培养第4天开始观察结果，连续观察3天判定结果。当病毒用量在30TCID，/50L300 TCID，/50L范围内，阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病
12、变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立.予以重做。4.2.6 判定标准在定量试验中，按Reed-muench或Karber方法计算半数保护量(PD，)，即为该血洁的中和效价.在定性试验中，被检血泊在1: 5稀释度时有两个或两个以上孔的细胞完全被保护，该血清即为SN/T 1129-2007 阳性。4.3 抗原捕获酶联免疫吸附试验4.3. 1 试验材料 牛病毒性腹泻/粘腹病抗原捕获凹.ISA诊断试剂盒2C8C保持.试lIJ盒内应包括的物品如下s牛病毒性腹泻粘膜病病毒多克险抗体包被板g抗BVDV单克隆检测抗体，BVDV阳性对照血泊3. BVDV阴性对
13、照血泊;辣根过氧化物院(HRP)标记的牛抗M抗体，10X样品稀释液，10X浓缩洗液gTMB底物溶液;终止液。4.3.2 样品的准备4.3.2. 1 组织样晶使用尽可能新鲜的组织样品.组织可在2C8C保存一个月或长期冷冻保存，样品最好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏，用剪刀将1g2 g样品剪碎(2mm5 mm).将剪畔的样品宜于10ml.离心管中，加入5ml.样品稀释液(1X).j昆匀，空ih!.l.作1h2 h.1 500 r/min离心10min，上清液作为检测样品备用。4.3.2.2 外周血波白细胞将肝素或EDTA抗凝血样10mL.2 000 r/min离心15min.-.20 min。用100
14、0L移液器吸取沉淀表层的淡黄色液体，重于500L样品稀释液中，每个样品换一个吸头。置室温1h.期间涡旋振荡数次，2500r/min离心5min，l:沂液作为检测样品备用。如果样品的压缩细胞体积非常小，则用所有的血细胞来操作(包括红细胞).将细胞转移到10ml.离心管中，并加入等体积2C 8C预冷的0.17 mol/1.的氯化钱(NH川l)洛ff.fi室温10min。加入2C8C预冷的超纯水(或双蒸水)适量，轻轻翻转摇匀.2500r/min离心5mino弃去上;青液，加入500L样品稀释液(1X)到血细胞中，每个样品使用新的吸头，涡动混匀.:rt室温1h.期间涡旋振荡数次。2500 r/min离
15、心5min.上消液作为检测样品备用。4.3.2.3 鼻拭子将拭子放入底部有小孔的微型商心管中(可用热针头打空).并将微型离心管放入另一个Eppendorf管中.2500r/min离心5mino弃去底部有小孔的微型管，并在Eppendorf管中加入与获得样品等体积的样品稀释液(1X). 混匀，宝泪下放宽1h2 h.期间振荡数次。2500 r/min离心5min，上清液作为检测样品备用。4.3.2.4 细胞培养物将细胞培养物3000r/min离心5mn，弃去上清液;加入5001.样品稀释液，轻轻振荡i昆匀，置于室温1h.作为检测样品备用。4.3.3 仪器与设备酶标仪(波长450nm或双波长450n
16、m/620 nm).振荡器，高速台式离心机，冰箱，温箱.8道或12道洗头洗板机.8道或12道移液(50L3001.) .8单道移液器(0.5I.IO1.，401.200 11., 200I.I 000L和2ml.IO mU.吸头(101.，2001.，1000 IL!.). Eppendorf管。4.3.4 试剂准备试剂盒各组分在使用前恢复至室温(20C25C)，O.17mol/1. NH, CI 溶液(提取臼细胞用);洗涤液:用蒸馆水将浓缩洗液稀n10 fliCl 10).混匀备用。稀释用蒸恼水应符合GB/T6682的要求。4.3.5 操作程序4.3.5. 1 加抗日VDV单克院检测抗体，I
17、ll8道或者12道移液器:(Erj标板每孔中加入50L抗BVDV.if.克隆检测抗体(试开IJ盒提供)。4.3.5.2 对!照g加501.阴性对照血泊至ftJ标板的AI，B1孔;加501.阳性对P.lI血清至A2、B2孔。4.3.5.3 加样=在酶标极的其他相/.Il孔中各加人50L已稀释好的被检样品。4.3.5.4 感作z将酶标板封板后.在振荡器上混合1min后，置2C8C下过夜感作14h18h或SN/T 1129-2007 37C下感ft3 h. 4.3.5.5 洗涤2弃掉各孔液体，每孔加入2501LL-300L已稀释好的洗涤液，轻轻振动后甩掠，连续洗涤5次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水
18、纸上轻拍，除去孔内剩余的液体。4.3.5.6 加酶标结合物=每孔加入100L辣根过氧化物酶CHRP)标记的牛抗鼠抗体。4.3.5.7 感作和洗涤:将酶标极封膜后，宜室温下，感作30min。重复4.3.5.5洗涤。4.3.5.8 加底物每孔加人100LTMB底物溶液。4.3.5.9 感作z将随标板宣20C-25C下黑暗处感作10min，从加完第一孔开始计时。4.3. 5. 10 加终止液z每孔加100ILL终止液，终止颜色反应。4.3. 5. 11 测定吸光值(00):(j标仪以空气作为空白对照，于15min内，在450nm波长下测量和记录样品和对照的00值。4.3.6 试验有效性检测只有在阳性
19、对照孔所得的平均倪减去阴性对照孔所得的平均值大于O.15，且阴性对照孔所得的平均值小于0.2时，测定结果才有效。4.3.7 结果计算和判定4.3.7. 1 结果计算按式(1)、式(2)和式(3)计算结果NCX (OOA十OOm)/2 式中sNCX一阴性对照血清孔00值的平均值$OO，-A1孔阴性对照血泊的00值;00m-B1孔阴性对照血清的00值。PCX二(002+ 002) /2 式中zPCX-阳性对照血清孔00值的平均值300.2一一-A2孔阳性对照血清的。D值;00，-B2孔阳性对照JiJJ.m的00值。. ( 1 ) ., ( 2 ) s/P OOS -NCX)/(PCX一NCX)(3
20、 ) 式中gs/P-被检血清00值与标准阳性血清00值的比值;OOs一样品孔的00值;PCX一一阳性对照血清孔。D们的平均值gNCX 阴性对照血清孔00值的平均值。4.3.7.2 结果判定如果S/P值小于0.20，样品!J为牛病毒性腹泻/粘膜病阴性z如果S/P值介于0.20和O.30之间，样品判为牛病毒性腹泻/粘膜病可疑，应重新检测;如果s/P值大于等于0.30，样品判为牛病毒性腹泻/粘膜病阳性。5 SN/T 1129-2007 附录A(资料性附录疾病概述A.1 牛病毒性腹泻/粘膜病(bovineviral diarrhea/mucosal disease , BVD/MD) 牛病毒性腹泻/粘
21、膜病是由牛病毒性阪泻病毒(bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的一种以粘膜发炎、服烂、坏死和腹污为特征的传染病。A.2 病原本病治伏期7天-14天。在I临床上分为急性、慢性经过。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高.重度腹泻，白细胞减少，大量流涎.口腔粘膜康烂和溃荡，可在发病后几天死亡。病母牛所产的较牛发生下俐，在口腔、皮肤、肺和的有坏死灶.在丰l1iIt升高的同时白细胞减少。慢性病例11市床症状不明显或逐渐发病，生长发育受阻，消瘦，体重逐渐下降。比较特殊的症状是鼻钱上的股烂，/辈烂l可在鼻钱上连成一片，表现为间歇性腹泻，有时因蹄nt炎导致肢行，病程较长.可在发
22、病几用或数月死亡。A.5 发病机理和病理变化持续性感染是BVD发病的重要环节，也是BVDV在自然环境中维持存在的种形式.它是由于提振母育在怀孕早期通过子宫内感NCP BVDV引起。此时胎儿的免疫系统尚未发育成熟.不能识到l外来的NCPBVDV，这种胎儿出生后一旦在活即成为持续感染牛，只临床表现正常，血济学阴性，即SN/T 1129-2007 处于免疫耐受状态，持久带毒、排毒。研究证实.CP和NCP型BVDV在致死性MD的致病饥理中都起着重要的作用。发生MD的前提条件是怀孕母牛在娃振早期感染NCPBVDV.其结果生产出持续感染较牛，这种持续感染棋牛对相应的NCPBVDV表现免疫耐受。持续感染动物
23、当再次感染抗原性相似或同源的CP型病毒时就会发生MD.而异源病毒能够被机体识别且不被免疫系统所耐受，这也正可以解释某些持续性感染的动物体内存在BVDV抗体的原因.本病的主要病理变化是消化道粘膜充血、出血、水肿和麽烂。特征性损害是食道粘膜有大小不等的形态与直线排列的魔烂，胃粘膜水肿和朦烂。A.6 检疫及诊断7 SN/T门29-2007B.l 培养液附录B(资料性附录)溶液配制MEM培养基，加入10%无BVD病毒抗体胎牛血清(56C, 30 min灭活l，含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL，抽滤除菌，置4C保存备用。B.2 维持液MEM培养基，加入2%元BVD病毒抗体胎牛血清(56C
24、.30 min灭活l.含青霉素200IU/mL.链霉素200IU/mL.抽滤除菌，置4C保存备用.B.3 细胞分散液膜酶乙二胶囚乙酸二锅无钙侯离子PBSl.匀抽滤除茵，置4C保存备用。B.4 无钙簇PBS氯化饷氯化何磷股氢二纳磷酸二氢何一级水2.50 g 0.20 g 1000 mL 8.0 g 0.2 g 1. 15 g 0.2 g 1000 mL 将上述成分依次溶解、混匀、分装、高压灭菌(68.94kPa.15 minl。B.5 磷酸盐缓冲液CPBS，O.OImol/L , pH7. 4) 氯化纳氯化何十二水磷酸氢二的磷酸二氢御8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 一级水1 00
25、0 mL 将上述成分依次溶解、混匀、分装、高压灭菌(68.94kPa. 15 minl. B.6 包被缓冲液【碳酸盐缓冲液CCB匀，0.05mol/L、pH9.6J碳酸纳碳酸氢纳氯化创加去离子水至1000 mL。1. 59 g 2.93 g 8.30 g B.7 洗液(含O.05 % Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS.&P PBST) Tween-20 0.5 mL B 加0.01mol/L , pH7. 4的PBS至1000 mL。B.8 底物缓冲渡(磷酸氢二锅拧核酸，pH5.4)0.2 mol/L十二水磷酸氢二纳0.1 mol汀，拧核酸去离子水26.7 mL 24.
26、3 mL 49.0 mL SN/T 1129-2007 使用前称40mg邻苯二胶WPDl溶解在上述溶液中，完全溶解后再加150L3%过氧化氢(H202) ，混合后立即使用。B. 9 终止波【2mol/L硫酸(H2SO，)浓硫酸去离子水22.2 mL 173.8 mL 9 中华人民共和国出人挠检验检疫行业标准牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范S:-J /T 1129-2007 安中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷，睡开本880X 1230 1/16 印张1字数17千字2007年11月第一版2口07年11月第一次印刷印数1-2000 书号155066 2-18214 定价10.00元
