1、中华人民共和国国家标准G/T 14965-94 食物中氨基酸的测定方法Method for determination of amino adds iD foods 1 主题内容与适用范围本标准规定了用氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法.本标准适用于食物中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缴氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酶氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmoL 本标准不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸测定。2 原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与部三翻
2、溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。3试tilJ全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。3- 1 浓盐酸g优级纯。3.2 6 mol/L盐酸g浓盐酸(3.1)与水1: 1混合而成。3. 3 苯酷z须重蒸饱.3. 4 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售): O. 002 50 mol/L。3- 5 缓冲液3. 5. 1 pH2. 2的拧橡酸纳缓冲液s称取19.6g拧糠酸销(Na，C，H50， 2H20)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000 mL.用浓盐酸或50%的氢氧化纳溶液调节pH至2.203. 5. 2 pH3. 3的拧橡酸销缓冲液g称取19.6g拧橡酸钢和12m
3、L浓盐酸加水稀释到1000 mL.用浓盐酸或50%的氢氧化销溶液调节pH至3.30 3.5. 3 pH4. 0的拧橡酸纳缓冲液.称取19.6g拧襟酸纳和9mL浓盐酸加水稀释到1000 rnL.用浓盐酸或50%的氢氧化纳溶液调节pH至4.00 3. 5.4 pH6.4的拧橡酸纳缓冲液z称取19.6 g拧攘酸锁和46.8 g氯化锅(优级纯)加水稀释到1000 mL.用浓盐酸或50%的氢氧化纳溶液调节pH至6.403.6 苟三酣溶液3- 6. 1 pH5. 2的乙酸铿溶液称取氢氧化铿(LiOH H20 )168日，加入冰乙酸(优级纯)279rnL.加水稀释到1000mL.用浓盐酸或50%的氢氧化纳溶
4、液调节pH至5.20 3- 6. 2 讳三嗣溶液z取150mL二甲基亚枫(C，H，OS)和乙酸惺溶液(3.6.1)50mL加入4g水合苟三嗣(C，H，O，H20)和O.12日还原芮三嗣(CHO. 2H，O)搅拌至完全潜解.3-7 高纯氮气g纯度.99%。中华人民共和国卫生部1994-03-18批准1994-09-01实施479 GB/T 14965-94 3. 8 冷冻剂z市售食盐与冰按1 3混合。4 仪器和设备4. 1 真空泵。4.2 恒温干燥箱.4. 3 水解管z耐压螺盖玻璃管或硬质玻鸦管.体积2030mL。用去离子水冲洗干净并烘L4.4 真空干燥器(温度可调节)。4. 5 氨基酸自动分析
5、仪。5 样品处理样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。6分析步骤6. 1 称样准确称取一定量样品，精确J!Jo. 000 1 g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在lO20 mg范围内s均匀性差的样晶如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品放于水解管中。6.2 水解在水解管内加6mol/L盐酸(3.2)1015 mL(视样品蛋白质含量而定)，含水量高的样品(如牛奶可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馆的苯盼(3.3)34滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3.5min.再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近ops仆，然
6、后充入高纯氯气:再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110士lC的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管.将水解液全部转移到50mL容量瓶内用去离子水定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真安子燥器在4050C手燥，残留物用12mL水溶解，再干燥.反复进行两次，最后蒸干，用1mL pH2. 2的缓冲液(3.5.1)溶解，供仪器测定用。7 测定准确吸取0.200mL混合氨基酸标准(3.4)，用pH2.2的缓冲液(3.5. 1)稀释到5mL，此标准稀释液浓度为5.00nmol/50L，作为上机测定用的氨
7、基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。8 计算AU n l M一 v-9 -MW F-x -m l一切一 c-X 式中zX一一样品氨基酸含量，g/lOOg; c 样品测定液中氨基酸含量，nmol/50LF一一样品稀释倍数pv一一水解后样品定容体积，mL;M 氨基酸分子量$480 GB/T 14965-94 m 样品质量.g;i一一折算成每毫升样品测定液的氨基酸含量，nmol/mL;50 109-一将样品含量自ng折算成g的系数。注:(i)样品氨基酸吉量在1.00 g/!OO g以下.保留两位有效数字，含量在1.00 g/IOO g以上，保留三位有效数字。十六种氨基酸分
8、子量天氨酸，133.1, 苏氨酸，119.1，丝氨酸105.1, 谷氨酸，147.1，脯氨酸;115.1;甘氨酸:75.1;丙氨酸，89目1，缅氨酸，117国2，蛋氨酸，49.2，异亮氨酸，131.2，亮氨酸，131.2，路氨酸，81.2, 苯丙氨酸d65. 2, 组氨酸，55.2.赖氨酸，146.2，精氨酸d74.2。9 允许差同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值运12%。10其他10. 1 测定条件(以Beckman-6300型氨基酸自动分析仪为例)缀冲液流量，20mL/h，部三嗣流量，10mL/h , 柱温，50、65和70(:, 色谱柱，20cm , 分析时间:42min
9、., 10.2 标准出峰顺序和保留时间481 出峰顺序1 天每氨酸2 苏氨酸3 丝氨酸4 谷氨酸5 脯氨酸6 甘氨酸7 丙氨酸8 绷氨酸10.3 标准图谱482 GB/T 14965-94 保留时间，mln5.55 6.60 7.09 8.72 9. 63 12. 24 13. 10 16. 65 9.63 14.98 29.12 38 .62 16.65 24 .52 25.76 9 10 11 12 13 14 15 16 出峰顺序蛋氨酸异亮氨酸亮氨酸酶氨酸苯丙氨酸组氨酸赖氨酸精氨酸5.55 6.60 9.09 8.12 13.10 21.24 22.06 34.62 12.24 40.7
10、5 保留时间.rnln19. 63 21. 24 22.06 24. 52 25. 76 30.41 32. 57 40.75 19.63 30.41 32.52 A1 测定条件缓冲液流量，mL/min部一嗣流量，mL/min柱温，C 色谱柱，mm分析时间.mln最低检出限，pmolA2 标准出峰顺序和保留时间出峰顺序1 天冬氨酸2 苏氨酸3 丝氨酸4 谷氨酸5 脯氨酸6 甘氨酸7 丙氨酸8 缴氨酸9 蛋氨酸10 异亮氨酸11 亮氨酸12 酶氨酸13 苯丙氨酸14 赖氨酸15 组氨酸16 精氨酸GB/T 14965-94 附录A其他型号氨基醺自动分析仪特点(参考件)HITACHl 835-50
11、 0.225 0.3 53 4X150 50 30 HITACHI 835-50 保留时间，mln9.88 10.86 1l.88 13.52 14.34 18.38 19.77 22.90 24.64 26.97 28.41 30.14 31.90 35.54 40.17 48.53 HITACHI L-8500 O. 4 0.3 57 4. 6X 60 30 10 HITACHI L-8500 5.90 6. 56 7.22 8. 15 8.86 11.25 12.08 13.38 14.58 16.78 17.86 18.83 19.64 21.98 24.16 28.20 483 14
12、965 94 GB/T 标准图谱A3 目 啤=-S 鸣喝伺3由。-d伺4ZaSMm 叫NmwN.NN h-mw创ay hFBR-伺-mw.-= N凶伺-.。踵-mHITACHI - 835 -dTN 盹-w.向何a. dyhm-Nd 也.。-何4响-z,-ud mN-d-的H-mNN-h E 。a-m。N-EN-TNN 组-hh时甸h-awe-NH 。-v-mw制嚣，。HITACHl L-8500 b. 回Al4但GB!T 14965-94 附加说明.本标准由卫生部卫生监督司提出，本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。本标准主要起草人费情斌、赵熙和。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。485
