1、ICS 65.020.30 B 43 中华人民共和国国家标准GB/T 31582-2015 牛性控冷冻精液Bovine frozen sexed-semen 2015-05-15发布2015-10-01实施产飞中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局也世啥时产中国国家标准化管理委员会a叩F 前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口.GB/T 31582-2015 本标准起草单位z农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京、内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司、北京奶牛中心、中国农业大学、全
2、国畜牧总站、农业部牛冷冻精被质量监督检验测试中心南京。本标准主要起草人z张晓霞、李喜和、周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、张海涛、刘玉、赵小丽、赵鹏、陆汉希、王建国、胡树香、施亮、张勇、钱松晋。I GB/T 31582-2015 牛性控冷冻精液1 范围本标准规定了牛性控冷冻精被技术要求、抽样、试验方法、判定规则和标识、包装。本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精辙。2 规黯性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 2828.2-2008计数抽样检验程序第2部
3、分z按极限质量(LQ)检索的孤立批检验抽样方案GB/T 2828.11-2008计数抽样检验程序第11部分z小总体声称质量水平的评定程序GB 4143 牛冷冻精液GB/T 5458 液氮生物容器3 术语和定义3. 1 3.2 下列术语和定义适用于本文件。性控冷冻精渡frozen sexed-semen 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。精子分离准确率X or Y ratio of sexed-semen X精子或Y精子占分离后精子总数的百分率.4 要求4.1 种公牛经审定或鉴定的公牛，体质健康，无遗传病，不允许有中华人民共和国动物防疫法中所明确的二类疫病中的任何一
4、种。4.2 新鲜精灌色泽乳白色或谈黄色，精子活力注65%，精子密度二三4X108个/mL，精子畸形率15%。4.3 每剂量解冻后精遣4.3.1 外观细管无裂痕，两端封口严密。1 GB/T 31582-2015 4.3.2 荆型、剂量细管冷冻精被z微型，剂量注0.18mLo 4.3.3 椅子活力注35%(即注0.3日。4.3.4 前进运动精子鼓注80万个。4.3.5 分离准确事二85%o4.3.6 精子畸形率15%o 4.3.7 细菌菌落撒运800个a5 抽样5.1 抽样幢幢方案5.1.1 生产方抽样检验按照GB/T2828.2一2008中第4章，采用极限质量LQ=20，模式A一次抽样方案，确定
5、抽样公牛样本量。5.1.2 质量监督抽样栓验按照GB/T2828.11-28中第6章，诙群体公牛为一核查总体，采用DQL=10.选用第I检验水平的抽样方案z查GB/T2828.11-2008中表B.2.确定抽样公牛的样本量。5.1.3 复栓和伸截抽样幢瞌复检可根据原抽样方案确定，仲裁应按照5.1.2规定的方案进行抽样检验，按照7.4.2规定的方案进行评定。5.2 抽样方法随机抽样.6 试验方法6.1 外观用目测法，其结果应符合4.3.1的规定。2 G/T 31582-2015 6.2 剂量检验按附录A中A.2规定的方法，其结果应符合4.3.2的规定。6.3 精子分离准确率检验按A.3规定的方法
6、，其结果应符合4.3.5的规定。6.4 解冻后精灌厨量精子活力、前进运动精子数、精子畸形率及细菌菌落数的检验按照A.4-A.8规定的方法，其结果应分别符合4.3.3、4.3.4、4.3.6、4.3.7的规定。7 检验7.1 检验分类7. 1. 1 常规栓验对冷冻精攘的单项目检验是型式检验的一部分，主要是在生产批人库前和销出库时的检验。7. 1.2 型式检验对冷冻精液全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督抽样检验时选定项的检验。7.2 检验项目7.2.1 常规检验按照4.3.1和4.3.3的规定。7.2.2 型式检验按照4.3.1.4.3.7的规定。7.3
7、 结果判定7.3.1 常规栓验样品中任何一项目检验未达到4.3.1和4.3.3的规定要求，则判为不合格。7.3.2 型式检验样品中任何一项目检验未达到4.3.1.4.3.7的规定要求，则判为不合格。7.4 抽样检验对群体质量水平的评定7.4.1 生产方抽样栓验生产方抽样检验按照GB/T2828.2-2008中第4章的规定，通过对样本检验，若样本中不合格品数等于或小于接收数Ac，1J(IJ接收该批(合格)，否则不接收该批(不合格。3 GB/T 31582-2015 7.4.2 质量监督抽样幢验按照GB/T2828.11-2008中规定，在样本中以不合格品数)L(不合格品限定数)，即抽栓样本符合要
8、求，核查通过E当dL，即抽检样本不符合要求，核查总体不合格。8 悻识、包装8.1 标识8.1.1 晶种种公牛的品种以代号表示，具体遵照GB4143的规定。8.1.2 内容应在细管壁和包装袋上印制以下内容，印制标识要清楚，并按以下顺序排列za) 生产单位代号Fb) 公牛品种zc) 公牛注册号pd) 生产日期或批次ge) 分离精子标记:X或Y。8.2 包装牛性控冷冻精液细管用塑料管包装，每个包装不得超过25剂。4 、酣最A(规范性附录牛性控冷冻精溃质量幢验方法A.1 抽样A. 1. 1 样晶的收集抽样z从贮存冷冻精液的液氮容器中按规定随机抽取样品。送样z将抽取的样晶送至质量检测机构。A.1.2 抽
9、样方案A. 1.2. 1 生产方抽样栓验按5.1.1确定样本数。A.1.2.2 质量监督抽样栓验按5.1.2确定样本数.A.1.2.3 抽样方法按牛号顺序排列，由抽样人员现场按样本头数随机确定各样品公牛。A.1.2.4 全部取梓对已投产的每头公牛取样。A. 1.3 取样方法GB/T 31582-2015 确定取样公牛，从贮存冷冻精液的液氮容器中随机抽取大于15剂的性控冷冻精鞭。A.1.4 样晶的保存存放性控冷冻精攘的被氨容器质量应符合GB/T5458的规定，使用前经过清洗后加入液氮，样品浸在液氮中，取放样品时在空气中暴露时间不得超过10S.由专人保管样品，样品不允许脱离液氮，抽样登记单与样品随
10、行。样品包装、标记应保持原样。A.2 剂量检测A.2.1 主要器材小试管、剪刀、刻度吸管，A.2.2 检测方法取2剂细管性控冷冻精液自然解冻后剪去超声波封口端，把精液推入一小试管内，用1.0mL刻度吸管准确吸取精液，并读取总精液量。5 GB/T 31582-2015 A.2.3 计算样品的剂量值为2剂性控冷冻精液总剂量的平均值，按式(A.D计算z式中zv-一一剂量值，单位为毫升(mL);n一一样品总剂量值，单位为毫升(mL)。A.3 X精子就Y精子分离准确率的栓测A.3.1 机器栓测方法A.3.1.1 主要器材V=? .( A.1 ) 流式细胞仪或精子纯度检测仪、循环恒温水浴锅、超声波发生器、
11、5mL试管、移被器、0.22m过滤器、50m过滤器。A.3.1.2 主要试剂及配制方法主要试剂及配制方法如下za) 荧光染料Hochest33342(0.05%):将10mg荧光染料Hochest33342定容于20mL双蒸水中，在5C条件下避光保存，有效期90d; b) Tris-sheath工作液(pH8.0):取Tris4.776 g，拧攘醺2.326g、D-果糖1.710g溶于120mL双蒸水中搅拌至完全溶解，用4mol/L的NaOH将pH值调到8.0，用双蒸水定容至200mL。该液用0.22m的过滤器过滤灭菌后添加国产青霉素2万单位、国产链霉素1万单位，置5C冰箱保存，有效期14d。
12、该液渗透压290mOsm士10mOsm. 注z以上化学试剂纯度均为分析纯。A.3.1.3 栓测方法在5mL试管里，先加20L荧光染料Hochest33342 (0.05 %) ，再加1mL Tris-sheath工作液(pH 8.0)充分混匀，最后将解冻后精被加入管内，精液体积范围30L，.，100L.混匀后放人34c水搭锅水浴20min.取出染好的精液，用超声被发生器断去精子尾部后，用50m过滤器过滤到5mL试管中。处理好的精液放置避光处。开启流式细胞仪，作好仪器图像定位。将处理好的精液放入加样器，按照流式细胞仪精子纯度检测操作流程，检测上述染色样晶。重复以上操作3次，取其平均值。染色后样品
13、应在4h内检测完毕。3次检测数据误差值大于5%时，应重新操作。A.3.1 .4 计算6 X精子的分离准确率按式(A.2)计算zA=Al+A2+As -3 . ( A. 2 ) 式中zA 一X精子性控平均分离准确率，%;A1二一X精子性控第1次检测分离准确率%1Az一一X精子性控第2次检测分离准确率，%;A3 -x精子性控第3次检测分离准确率，%。A.3.2 精子特异性DNA探针栓副方法A.3.2.1 主要器材荧光显微镜、培养箱、干燥箱、干播器、移液器.A.3.2.2 主要试剂及配制方法主要试剂及配制方法如下za) PBS，取袋装PBS干粉用1000mL双蒸水稀释，室温保存，b) Y精子特异性D
14、NA探针，-20c保存zGB/T 31582-2015 。10%胃蛋白酶z称0.1g胃蛋白酶加1mL双蒸水(提前预热到37C) .25L分装，一20c 保存sd) 0.005%胃蛋白酶:25L的10%胃蛋白酶加入49.5mL双蒸水以及0.5mL 1. 0 mol/L的盐酸，37c水浴se) Solution A:称取0.121g Tris碱和0.9g NaCl溶于100mL双蒸水，充分混匀，4c保存备用$f) Solution B:称取0.3856g DTT禧于1mL精子洗撮掖，充分吸打渴句，-20c保存备用Fg) Solution C:称取1g SDS和1.9g四跚醺铀溶于100mL双蒸水中
15、，反复颠倒混句，室温保存备用Fh) 20XSSC:称取87.6g NaCl , 44.1 g拧攘酸锅，溶于500mL双蒸水中(用盐酸将pH调到7.0) .高压灭菌，4c保存备用pi) 2XSSC榕攘(pH7.0):在一个量筒里量出100mL的20XSSC潜掖，与约880mL的双蒸水混合，用1mol/L的HCl溶被将pH调到1.0，用双蒸水将榕被定容到U1 L，高压灭菌，军温下存储。如果有任何可见的沉淀，就要丢弃溶液sj) 0.4XSSC溶液(H7.0): 20 mL的20XSSC溶液与约970mL双蒸水混合，用1mol/L的HCl榕液使pH下降到7.0，用双蒸水使被体量达到1L，用1mol/L
16、的HCl将pH调到7.0，用双蒸水将溶液定容到1L，高压灭菌，室温下存储，如果有任何可见的沉淀，就要丢弃榕液zk) 0.4XSSC禧液，pH 7.0/0.3% NP-40:50 mL的0.4XSSC(pH7.0)加上150L的NP-40，均匀混合F1) 2XSSC榕液，pH 7.0/0.1% NP-40: 50 mL的2XSSC(pH7.0)加上50L的NP-40，均句混合Fm) 1 mol/L甘氨酸(pH8.5) : 7.05 g甘氨酸加入100mL双蒸水，室温保存Fn) 甲醒固定液z依次取12.5mL 10%中性甲踵，37mL PBS, 2.5 mL 1 mol/L MgC12 ，混合均匀
17、。室温保存F0) DAPI。注g以上化学试剂纯度均为分析纯.A.3.2.3 栓测方法取一剂细管牛性控冷冻精液置37c水播解冻，推入1.5mL试管中，精子用椿液A离心洗涤后将GB/T 31582-2015 其浓度调至2.5X108/mL.依次使用溶被B、榕液C、无水乙蹲处理精子使其解凝聚，然后滴片、烘干。烘干后的片子在冰箱中放置过夜，隔天取出片子晾干后，首先在2XSSC(pH7.0)孵育，然后用胃蛋白酶搭液消化，消化后的片子用1XPBS冲洗，甲醒固定，最后用70%、85%、100%乙蹲处理。将处理好的精子玻片上滴上精子特异性DNA探针封片，杂交过夜。隔天在0.4XSSC溶液(0.3%NP-40)
18、榕液中除去封片肢，在2XSSC(0.1%NP-40)禧液中除去盖玻片，最后依次使用0.4XSSC癖液(pH7.0)、2XSSC溶液(pH7.0)榕被洗片，片子风干后滴上DAPI在显微镜下计数。统计具有蓝色荧光的总精子数和绿色杂交点的Y精子数。每次检测2张带有精子样品的载玻片，每张载玻片计数200个左右的精子，最后计算出总数。A.3.2.4 计算X精子的分离准确率按式(A.3)计算z式中zA一-x精子性控分离准确率.%;y-y精子数，单位为个FT一一总精子数，单位为个。A.4 精子活力的检测A.4.1 主要仪器和器材A = (1-) X 100 .( A.3 ) 相差显微镜、电视显微系统、计算机
19、、恒温水浴箱、5.0mL试管、载玻片或精液性状板、盖玻片、显微镜恒温装置、移液器。A.4.2 幢测方法2剂细管性控冷冻精被分别直接置于37c水播中解冻，取解冻后混合精被约20L置于载玻片上，加盖玻片后立即在200倍400倍相差显微镜或电视显微系统上观察活力，载物台温度保持38C. 每个样品观察3个视野。A.4.3 计算精子活力是3个视野精子活力评价值的平均数，按式(A.的计算z式中zM一一精子活力.%，nl一一第一视野活力评价值.%，na一一第二视野活力评价值.%，m一一第三视野活力评价值.%。A.5 每剂量中精子总数幢测A.5.1 主要器材M=!.1 +nZ +n3 3 .( A.4 ) 血
20、球计数板、血色素管、1mL刻度吸管、小试管、计数器、移液器、显微镜或电视显微系统.GB/T 31582-2015 A.5.2 栓测方法准确吸取20L解冻后精液，注人盛有0.98mL的3.0%氧化铀榕液的试管内，混匀，使之成为50倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数窒盖好，用移液器吸取稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流人计数室，均匀充满，在显微镜下或电视显微系统上观察计数。A.5.3 计算每剂量中精子总数按式(A.5)计算zS =Q X 104 x 50 X V 式中tS一一每剂量中精子总数，单位为个FQ一一计数室25个中方格的总精子数，单位为个FV一剂量值，单位为毫升(mL)。.
21、( A.5 ) 每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过5%，则应重检。A.6 每剂量中呈前进运动精子鼓每剂量中呈前进运动精子数按式(A.6)计算zC=SXM 式中EC-一一每剂量中前进运动精子数，单位为个FS一一每剂量中精子总数，单位为个EM一一-精子活力，%。A.7 精子畸形率的检测A.7.1 主要器材显微镜、载玻片、血球分类计数器、染色板、吸管。A.7.2 主要试剂及配制A.7.2.1 磷酸盐罐冲液.( A.6 ) 取磷酸二氢铀(NaHzPO， 2HzO) 0.55 g、磷酸氢二铀(NazHPO， 12HzO)2.25 g，双蒸锢水定容至100mL. A.7.2.
22、2 中性福尔马林固定蘸取磷酸二氢销(NaH2P04 2HzO)0.55 g、磷酸氢二锅(NazHP04 12HzO)2.25 g，用0.89%氯化销约50.0mL榕解后加入8.0mL 40%甲醒HCHO(使用前经磺酸镜中和过滤)，再加0.89%氯化铀溶被定容至100.0mL. A.7.2.3 姬姆萨原搜分别用量筒量取甘油CaHs(OH)3J66.0 mL、甲酶(CHaOH)66.0 mL。将姬姆萨染料1.0g放人研钵中加少量甘油充分研磨至无颗控为止，然后将甘袖全部加入并置60c恒温箱中，溶解4h后，再加GB/T 31582-2015 人申蹲充分溶解，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果
23、越好。A.7.2.4 姬姆萨染溃取姬姆萨原被(A.7.2.3)2.0mL，加磷酸盐缓冲液3.0mL及蒸锢水5.0mL.现配现用。以上所用化学试剂纯度应达到分析纯.A.7.3 制片染色、镜栓、计算A.7.3.1 掠片取解冻后精被1滴，滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片成35。夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干约5min) ，每样品制作2个抹片。A.7.3.2 固定在巳风干的抹片上滴1.0mL.2.0 mL中性福尔马林，固定15min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。A.7.3.3 染色将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染掖滴于槽和抹片之间。让
24、其充满平槽并使抹片接触染戳，染色1.5h后用清水缓缓冲去染壤，晾干待检。A.7.3.4 镜栓将制备好的抹片在显微镜(400倍.600倍下观察，每个抹片观察200个以上的精子(分左、右2个区)，取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。A.7.3.5 计算精子畸形率按式(A.7)计算zA二会X100 .( A.7 ) 式中zA 一一精子畸形率，%;A1 畸形精子数，单位为个zS 一精子总数，单位为个。A.8 细菌菌落数的检测A.8.1 主要器材培养箱、超净化工作台、天平、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、培养皿。A.8.2 培养基的配制普通琼脂的制作z取牛肉漫膏5.0g、蛋白陈1
25、0.0g、磷酸氢二饵(KzHPO. 3HzO) 1. 0 g、氧化铀(NaCD5.0 g，用蒸锢水1000mL溶解后加琼脂输20g加温融解。调整pH至7.4-7.6，并用脱脂棉过滤，分装于三角烧瓶中经高压灭菌(0.1MPa, 20 min)。也可使用营养琼脂培养基.GB/T 31582-2015 A.8.3 栓测方法将每份样品制作灭菌平皿2个并标注样品号。取2剂细管性控冷冻精液在37c水播中解冻，细管用酒精棉球消毒后分别注于2个灭菌平皿内z在无菌条件下，把50c 52 c的培养基倒人平皿内，每平皿15mL，并水平晃动平皿使精液混合均匀，待琼脂凝固后倒置平皿，同时作空白对照平皿，置37c 恒温箱
26、内培养48h取出，统计出每个平皿内细菌菌落数。A.8.4 计算样品的细菌菌落数为2个平皿中统计菌落数的平均值，按式(A.8)计算z式中EB 一一细菌菌落数，单位为个Fn)一一第1个平皿菌落数，单位为个sn2一一第2个平皿菌落数，单位为个。B=nt+nz 一一2 .( A.8 ) 的FON|N的FmH阁。国华人民共和国家标准牛性控冷冻精遣G/T 31582 2015 中* 中国标准出版社出版发行北京市割阳区和平墨西街甲2号(100029)北京市西城区三星测北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1字数24千字2015年6月第一版2015年6月第一次印刷 H号I155066. 1-51985 18.元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价
