1、 , ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准GB/T 31730-2015 水稻中转基因成分测定膜芯片法Detection of genetically modified components in rice-一Membrane-based array method 2015-06-02发布2015-09-01实施4队防重归.dFJ舍，忡/院鄂SZZ酬S I朱自豆豆咔中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局也全中国国家标准化管理委员会a叩GB/T 31730一2015前-一日. 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准由中国标准化研究院归口。本标准起草单位z四川华
2、汉三创生物科技有限公司、中国标准化研究院、黑龙江省粮油卫生检验监测站。本标准主要起草人z黄广平、云振宇、尹志坚、胡太贵、孙昭、张瑶、王勇强、董政红、宋廷瑞、张金龙、刘贞。, I -1 、 4 GB/T 31730-2015 水稻中转基因成分测定膜芯片法范围本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法，本标准适用于转BAR基因耐除草剂水稻和转Bt基因(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫水稻中转基因成分的快速定性检测，也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测。本标准规定的转基因成分最低检测限量是1g/峙。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日
3、期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.1 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.3 转基因产品检测核盖章提取纯化方法GB/T 19495.6转基因产品检测基E有片栓酒方法GB/T 19495.7转基因产品检测抽样和制样方法3 术语、定义和缩暗语3.1 术语和定义GB/T 19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件。3.2 缩暗语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyri
4、bonucleicacid) dNTP:脱氧核昔酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) dATP:脱氧腺昔三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP:脱氧胞昔三磷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP:脱氧鸟昔三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate) dTTP:脱氧胸昔兰磷酸(deoxythymidinetriphosphate) dUTP:脱氧尿背三磷酸(deoxyuridinetriphosphate) bp:碱基对(basepair) BAR:草丁腾乙酷转移酶基因(phos
5、phinothricinacetyltransferase gene) Cry1Ab:苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白crylA(b)基因Bacillusthuringiensis insecticidal toxin crylA (b) geneJ Cry1Ac:苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白crylA(c)基因Bacillusthuringiensis insecticidal toxin crylA (c) geneJ 1 GB/T 31730-2015 CaMV35S-P:花椰菜花叶病毒的35S启动子(promoterfrom cauliflower mosaic virus) NOS-3 :腼脂碱
6、合成酶基因终止子(terminationsequence of the nopaline synthase gene) CaMV35S-T:花椰菜花叶病毒的35S终止子(terminationsequence from cauliflower mosaic virus) GOS9:水稻gos9基因Oryzasat1.昭(rice)gos9 geneJ PC:阳性对照(positivecontroD NC:阴性对照(negativecontrol) UNG酶z尿嘻睫-N-糖基化酶(UNG酶)(uracil N -glycosylase) Taq酶:Thermus aqticus DNA聚合酶(T
7、hermusaquaticus DNA polymerase) AminolinkerC6 : 6个碳原子作为连接臂的氨基标记(C6Amino linker) 4 原理根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重PCR引物，对样本进行多重PCR扩增.PCR引物上修饰有生物素。若样本中出现目标片段而得到PCR扩增产物，PCR产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交。杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链毒亲和素反应，以及碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色，则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号。依据膜芯片上杂交点的显色情况，判断样本中是否含有待检转基因成分，检测结果可以用肉眼直接判断，
8、或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。5 试剂与标准晶5.1 试剂5. 1. 1 试剂组分本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和5.1.2-5.1.4的规定。除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GBjT6682规定的二级水。5. 1.2 引物PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。表1PCR反应使用的引物序列目标基因引物名称序列扩增片段大小Forward 5 -CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3 BAR 193 bp Reverse 5 -biotin-GT ACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3 Forward 5 -GACATGAACAGCGCCTTGAC-
9、3 Cry1Ab 164 bp Reverse 5 -biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3 Forward 5人GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3 Cry1Ac 161 bp Reverse 5 -biotin-GAGAAGATGGATGAA TT ACCCCA-3 Forward 5人GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3 CaMV355-P 144 bp Reverse 5 -biotin-TCATCCCTT ACGTCAGTGGA-3 2 GB/T 31730-2015 表1(续)目标基因引物名称序列扩增片段大小Forward 5 -TGCATG
10、ACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3 , NO&-3 113 bp Reverse 5 -botin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3 , Forward 5 -CCAGAT AAGGGAA TT AGGGTTC-3 CaMV35&-T 132 bp Reverse 5 -botn-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3 , Forward 5 -GACGATCCGT AGTGGAGC-3 GOS9 117 bp Reverse 5 -botn-GT AA TCGT AGTGGATTTCCACC-3 5. 1.3 探针膜芯片表面包被的目标基因探
11、针序列应符合表2的规定。表2目标基因探针序列名称序列修饰基因5 -CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGAC-BAR 5 -AmnolnkerC6 GTGGGTTTCTG-3 5 -GCAGCT AA TCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTT AGCGTGTTTGGG-CrylAb 5 -AmnolnkerC6 CAAAGGTGGGG-3 5 -TCT ACCAGAT AT AGAGTTCGTGTGAGGT ATGCTTCTGTGACCCCTAT-CrylAc TCACCTCAACGT-3 5 -AmnolinkerC6 I
12、 5 -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA-CaMV3S&-P 叫叫AGTGGATTGATG-3 5 -TT ATGA TT AGAGTCCCGCAA TT AT ACA TTT AA T ACGCGAT AGAAAA-NO&-3 5 -AmnolinkerC6 CAAAA T AT AGCGC-3 5 -AGCAT AT AAGAAACCCTT AGT ATGT ATTTGT ATTTGT AAAA T ACTT-CaMV35S T 5 -AmnolnkerC6 CTATCAAT AAAA T-3 5 -GCCTTT ACAT AC
13、GTTGGCACGGACGGGAA TGAACATCTTGCAGGTCC-GOS9 5 -AmnolnkerC6 TTGGGGTGGTGG-3 5 -GCATCCAGATCAGAAGCAA T AA TGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTG-PC 5 -AmnolnkerC6 TCCAAAGT ACCAG-3 5 -GGTTCCTTGAGAAA TGTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGAT-5 -AmnolnkerC布NC GATCCT A TTTTC-3 注z阳性寡核管酸单链DNA(Postve-Olgo，10mol/L) :核昔酸序列与阳性对照核酸探针(PC)序
14、列互补，用于膜芯片杂交过程质量控制，5端带生物萦(botin)标记，序列如下z5 -botn-CTGGT ACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATT A TTGCTTCTGATCTGGATGC-3 5.1.4 其他试剂5.1.4.1 碱性磷酸酶标记链霉亲和素(AP吼reptavidin)。5.1.4.2 碱性磷酸酶化学显色底物5-澳-4-氯-3-呵!喋磷酸和氧化硝基四氮唾蓝(BCIP/NBT)。3 GB/T 31730-2015 5.1.4.3 磷酸二氢铀CNaH2P04 H20). 5.1 .4.4 乙二胶囚乙酸二销CEDTA-2Na.C10H14N2Na2 08)
15、。5.1 .4.5 十二烧基磺酸销CSOS，C12H2S S03 Na). 5.1 .4.6 氢氧化铀CNaOH)。5. 1.4.7 氯化铀CNaCD.5.1 .4.8 多重PCR即用型预混液CMultiplex PCR Master Mix): MgCb 3 mmol/L. dA TP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP各0.4mmol/L. UNG酶4X104 U/L. Taq酶8X104U/L. 5. 1.4.9 多重PCR引物预报液CMultiplexPCR Primer Mix):每条引物2mol/L.5. 1.4.10 20 X SSPE缓冲液:3mol/L NaCl.200
16、mmol/L NaH2P04 .20 mmol/L EOTA.pH7.4. 5. 1.4.11 去活化液:100 mmol/L NaOH。5. 1.4.12 去活化清洗液:2XSSPE.0.1%SDS. 5.1 .4.13 杂交掖:2XSSPE.0.1%SDS。5. 1.4.14 杂交清洗液:2XSSPE.0.5%SDS. 5. 1.4.15 酶孵育液;2XSSPE.0.5%SOS. 5. 1.4.16 孵育清洗液1:2XSSPE.0.5% SOS. 5. 1.4.17 孵青清洗液2:2XSSPE。5. 1.4.18 底物显色被2碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP，含0.15mg/mL B
17、CIP.0.30 mg/mL NBT.100 mmol/L Tris-HCl.5 mmol/L MgC12.pH9.5. 5.2 标准晶5.2.1 LLRice62 Rice转基因水稻标准品LLRice62品系，包含BAR，CaMV35叩.Ca.MV355-T转基因成分。5.2.2 BT63 Rice转基因水稻标准品BT63品系，包含Cry1Ab，CrylAc.NOS-3转基因成分。5.2.3 Non-Modified Rice非转基因水稻标准品。6 仪器与设备6.1 基因扩增仪。6.2 核酸微量分光光度计。6.3 纯水仪。6.4 分析天平z精确到0.001g。6.5 膜芯片识读仪。6.6 台
18、式离心机z转速12000 r/min. 6.7 分子杂交炉。6.8 其他相关仪器和设备。7 试验方法和流程7.1 膜芯片检测流程膜芯片法检测流程参见附录B.7.2 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行。4 . 7.3 抽样和样晶和l备要求7.3.1 实验室抽样要求实验室样品代表性应符合GB/T19495.7的规定。7.3.2 样晶的保存GB/T 31730-2015 标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1的规定执行。7.3.3 样晶的制备所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2的规定执行，小心操作确保防止任何的污染和样品
19、组分的改变。7.3.4 DNA的提取样品中DNA的提取，应按照GB/T19495.3中的规定执行，或采用同等功能的植物基因组DNA提取试剂盒。并对提取后的样品DNA进行定量。每个测试样品提取时应做两个提取重复。7.3.5 PCR扩增7.3.5.1 PCR反应体系按照表3配制PCR反应体系。每次实验中，利用转基因水稻标准品的基因组DNA作为阳性质控，非转基因水稻标准晶的基因组DNA作为阴性质控，核酸提取空白作为空白质控，以对后续的PCR扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控。表3PCR反应体系体积(50p.L) 反应液组成检副反应阳性质控阴性质控空白质控一一z Multiplex PCR Master
20、 Mix 25L 25L 25L 25L Multiplex PCR Primer Mix 5L 5L 5L 5L 检测样品基因组DNA200 ng 转基因水稻标准品基因组DNA200 ng 非转基因水稻标准品基因组DNA200 ng 核酸提取空白10L 无核酸酶灭菌水补水至50L补水至50L补水至50L补水至50L注:PCR体系最终含有MgClz1.5 mmol/L，dATP，dCTP、dGTP、dTTP和dUTP各0.2mmol/L, UNG酶1U, Taq酶2U，每条引物0.2mol/L。7.3.5.2 PCR反应循环参数按照表4设计PCR反应参数。5 G/T 31730-2015 表4
21、PCR反应参数步骤温度1 37 c 2 95 c 3 95 c 4 55 c 5 72 c 6 72 c 7 4 C 注=步骤3、4、5循环40次.7.4 膜芯片杂交7.4.1 膜芯片制备膜芯片制作和质量控制参见附录C。7.4.2 杂交体系按照表5配制杂交体系液。表5杂交体系组分杂交液(2XSSPE，0.1%SDS) PCR扩增产物阳性寡核背酸单链DNA(Positive-Oligo10mol/L) 总体权7.4.3 酶孵育体系按照表6配制酶孵育体系攘，用前新鲜配制。表6酶孵育体系组分孵育液(2XSSPE，0.5YoSDS) 碱性磷酸酶标记链霉亲和素(lP-streptavidin)总体积L一
22、7.4.4 杂交、酶联及显色7.4.4.1 杂交检测方式z反应时间10 min 10 min 305 305 305 10 min 00 体叙/L979 20 1 1000 体积/L999.5 0.5 1000 、GB/T 31730-2015 本步骤有手动操作和自动杂交仪测定两种选择。7.4.4.2 手动过程z将膜芯片置于杂交盒内，按表7进行手动杂交。杂交过程在分子杂交炉中进行，类似仪器应满足实验要求。表7腰芯片孚动杂交过程过程名称步骤去活化加入去活化液，37C ,8 min，吸除去活化液去活化清洗加入去活化清洗液，60C ,5 min，吸除去活化清洗波杂交加入杂交体系液，42C , 45
23、min，吸除杂交体系液杂交清洗(2次加入杂交清洗液，52C , 5 min.吸除杂交清洗液，该过程重复2次酶孵育加入酶膊育体系波，42C .30 min.吸除酶辩育体系液掰育清洗1(2次加入孵育清洗液1，42C ,5 min，吸除孵育清洗掖1.该过程重复2次孵育清洗2(2次加入孵育清洗液2，37C .5 min.吸除孵育清洗液2.该过程重复2次显色加人显色浓.37C.静止显色15min.吸除显色液显色清洗(2次加入去离子水.37C, 5 min.吸除去离子水，该过程重复2次结果判读根据杂交点显色情况进行结果判读一二7.4.4.3 自动杂交仪测定过程:具有自动杂交、清洗反应功能的仪器，可以按照表
24、8流程所示，依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤。表8自动杂主仪副定过程-一一一一一程序名称试剂名称温度/C时间/min去活化去活化液37 8 去活化清洗去活化清洗液60 5 杂交杂交波42 45 杂交清洗杂交清洗液52 5 杂交清洗杂交清洗液52 5 酶孵育孵育液42 30 孵育清洗1孵育清洗液142 5 辩育清洗1孵育清洗液142 5 孵育清洗2孵育清洗液237 5 孵育清洗2孵育清洗液237 5 显色显色液37 15 显色清洗去离子水37 5 显色清洗去离子水37 5 结果判读根据杂交点显色情况进行结果判读7 GB/T 31730-2015 7.5 膜芯片结果判读7.5.1
25、 目测判读显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果。阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点。如果杂交点部位没有显色，和膜芯片背景相同，则判读为阴性杂交信号。7.5.2 膜芯片识读仪判读膜芯片显色后，使用膜芯片识读仪进行扫描分析，根据杂交点的信号值判断检测结果，阳性杂交信号的判断阔值是3倍背景信号值加上3倍背景信号值标准差。8 结果判断8.1 质量控制8. 1. 1 核酸提取空白对照和多重PCR扩增试剂空白对照膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性，转基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。8. 1.2 非转基因标准晶对照膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性，转基
26、因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳性吗阴性对照探针点杂交信号阴性。8. 1.3 转基因标准品对照膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性，标准品中所含转基因探针点杂交信号阳性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。8.2 膜芯片结果判读8.2.1 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性，表明未能从样本中提取出适宜多重PCR扩增的核酸模板，需要重新进行样本核酸提取和多重PCR扩增。8.2.2 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性，转基因探针点杂交信号阴性，表明样本核酸提取、多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常，判断样本中未检出测定转基因成分。8.2.3 样本检测结果中
27、内源基因探针点杂交信号阳性，各转基因探针点杂交信号部分或全部阳性，表明样本核酸提取、多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常，判读样本中存在阳性信号点对应的转基因成分。8.2.4 膜芯片杂交检测结果应符合8.1.1-8.1.3对照情况。否则应判断实验不成功，需重做实验。9 结果表述9.1 未栓出在阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点检测结果正常的情况下，未检出本标准所包括的转基因成分。9.2栓出检出xxxx基因，阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常。8 GB/T 31730-2015 附录A资料性附录膜芯片法试剂组分和存放条件膜芯片法试剂组分和存放条件参见表A.1.表A.1 膜芯片
28、法试剂组分和存放条件序号试剂组分存放条件1 多重PCR即用型预混液-20 c 2 多重PCR引物预混液-20 c 3 无核酸酶灭菌水一20c 4 转基因标准品基因组DNA(50ng/ILL) 20 c 5 阳性寡核背酸单链DNA-20 c 6 去活化液室温7 去活化清洗液室温8 杂交液室温9 杂交清洗液室温10 踌孵育液室温11 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素4 C 12 孵育清洗液1室温13 孵育清洗浓2室温14 配IP/NBT显色底物4 C 一一一15 膜芯片室温一一-一9 GB/T 31730-2015 膜芯片法检测按照图B.l流程进行.附录B(资料性附录)膜芯片法检测流程待测样品核酸提取多
29、重p扩培膜芯片杂交和清洗芯片结果判读报告结果圈B.1膜芯片法检测流程10 . -GB/T 31730-2015 附最C资料性附录膜芯片制作与质量控制C.1 肆芯片制作采用微定量喷点式膜芯片点样仪，将各个核昔酸探针(探针浓度25mol/L)分布在带负电荷尼龙膜芯片上的特定位置区域。芯片表面包被的探针布局如图C.l所示。杂交阳性对照IPC，监测芯片杂交过程是否正常。内对照:GOS9，指膜芯片上用来质控PCR扩增过程是否正常的对照，使用水稻特异性内源基因gos9扩增片段互补的一段寡核昔酸作为探针。阴性对照，NC，指膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照。一般使用一段与任何靶标分子序列无关的寡核昔酸作为
30、探针，墙边 需望GOS9 BAR CrylAb CrylAc CaJv1V35S-P NOS-P3 侈 CaMV35S-T PC NC 圈C.1膜芯片探针布局C.2 膜芯片的质量控制膜芯片点样后扫描无漏点、连点，位点规则，大小均句一致，点与点的距离为300m500fLm;杂交后阳性质控实验杂交信号清晰可见。mFONlomh例H泣。中华人民共和国国家标准水稻中转基因成分测定醋芯片法GB/T 31730-2015 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平墨西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销善开本880X12301/16 印张1字数24千字2015年6月第一版2015年6月第一次印刷昏书号:155066. 1-51737定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107打印日期:2015年6月17日F002
