1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31802-2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Tomato s potted wilt virus 2015-07-03发布2015-11-20实施/飞阳岛附.呐啊防毒4Q6Sl喝叫勺叮中华人民共和国国家质量监督检验检蛮总局峪舍中国国家标准化管理委员会。叩中华人民共和国国家标准番茄撒藩病毒检擅鉴定方法GB/T 31802-2015 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010
2、)68533533发行中心1(010)51780238读者服务部1(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X1230 1/16 印张1字数24千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷* 号:155066. 1-49517定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 31802-2015 前吉本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局
3、。本标准主要起草人z李桂芬、鲁洁、马洁、孔君、王秀芬、杜智欣、张永江、魏梅生。I GB/T 31802-2015 番茄斑萎病毒检瘦鉴定方法1 范圄本标准规定了植物检疫中番茄斑萎病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 仪器设备及试剂3.1 仪器设备酶标仪、天平(感量1/10000g)、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电
4、泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器(2L，10L，20L，100L，200L，1000L)、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌土等。3.2 试剂酶联免疫吸附测定试剂见附录B，RT-PCR检测试剂见附录C，实时荧光R下PCR检测试剂见附录D，生物学测定试剂参见附录E。4 抽样与样晶制备4.1 抽样抽样按照SN/T2122的规定进行。4.2 种子样晶制备将种子重点挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌士中，于25C生长并进行症状观察。待长出3片4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为一组)并编号。采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测、实时荧光R
5、T-PCR检测及生物学测定。4.3 苗木样晶制备将苗木种植于隔离温室中，于25C生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同4.2.1 GB/T 31802-2015 5 撞在鉴定方法5. 1 酶联免瘟眼附测定见附录B.5.2 RT-P检测见附录C.5.3 实时荧光RT-PCR幢测见附录D.5.4 生物学测定参见附录E.6 结果判定样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性，判断待检样品不携带番茄斑萎病毒。样品经酶联免疫吸附测定为阳性，RT-PCR检测或实时黄光RT-PCR检测为阳性，即可判断待捡样品携带番菇斑萎病
6、毒。必要时可进行生物学测定。7 样晶保存与结果记录7.1 样晶保存经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存，种子可在4C保存1年，病株可在一20c或一80C冰箱中保存1年，做好标记和登记工作。7.2 结果记录完整的记录包括z样晶的来据、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并应有经手人和实验人员的签字。酶联测定应有酶联板反应的原始数据.RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR应有反应原始数据，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。2 . GB/T 31802-2015 附录A(资料性附录番茄斑薯病毒相关资料A.1 背景资料A. 1. 1 基本信息番茄斑萎病毒学名:T
7、omato spotted wilt virus，缩写:TSWV. 分类地位z布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。A.l.2 方法原理根据番茄斑萎病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测，根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定s根据该病毒核酸的序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。条件允许的情况下，根据番茄斑萎病毒侵染寄主的症状特点，进行生物学检测。A.2 寄主范围番茄斑萎病毒寄主范围非常广泛，包括温带、亚热带和热带的80多个科近千种双子叶和单子叶植物，可引起许多重要的园艺植物
8、和农作物的严重病害，如花生、高宦、番木瓜、豌豆、烟草、甜椒、番茄、秋海棠、菊花、大丽花等。A.3 病害症状番茄斑萎病毒侵染不同的寄主及农作物后所产生的症状各不相同，常见症状为叶片上产生黄色或褐色的环斑或线纹斑，有的叶片上形成坏死斑，在叶辆和茎轩上产生黑色条纹。发病植株通常矮化或顶枯，有的萎藩而最终死亡。A.4 分布番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒，分布于欧洲和地中海地区、亚洲、非洲、北美洲、中美洲和加勒比海、南美洲和大洋洲。A.5 传播方式番茄斑萎病毒容易通过介体-一前马以持久性方式进行自然传播，机械接种和嫁接也可传播，还可以随寄主植物种子、苗木等进行国际间传播，特别是这些
9、寄主带有传毒介体时更容易传播该病毒。A.6 植体形菇病毒粒子球形，表面有一层膜包裹，膜外面由厚5nm、几乎连续的突起层组成，粒体直径80nm-120 nm. GB/T 31802-2015 A.7 基因组特征三分体基因组，基因组总长为16600 nt. ssRNA-L * 8 897 nt，为负义;ssRNA-M* 4821时，为双义;ssRNA-S长2916时，为双义，4 4、附暴B(规范性附录双抗体夹心酶联兔瘟眼附测定B.l 试剂B.l.l 包被抗体特异性的番茄斑萎病毒抗体。B.l.2 酶棕抗体碱性磷酸醋酶标记的特异性的番茄斑萎病毒抗体。B. 1.3 鹿物对硝基苯磷酸工销(pNPP)B.l
10、.4 包被锺坤灌(pH9.6) 碳酸铀(Na2C03)1.59 g 碳酿氧铀(NaHC03)2.93 g 叠氯铀(NaN3)0.20 g 蒸馆水定容至1L.4 C储存。B.l.5 PBST疆坤遭(pH7.4) 氧化铀(NaCD8.0 g 磷璋二氢饵(KHzP04)0.2 g 磷酸氢二锅(NazHP04)1. 15 g 氧化饵(KCl)0.2 g 吐温-20(Tween-20) 。.5mL 叠氮销(NaN3)0.2 g 蒸锢水定容至1L. B. 1.6 样晶抽提缓冲攘(pH7.4) PBST 1L 亚硫酸铺(NaZS03)1.3g PVP(MW24 00040 000) 20.0 g 叠氮铀(N
11、aN3)0.20 g 4 C储存。B. 1.7 酶标抗体稀膺缓冲霞(pH7.4) PBST 1L BSA(牛血清白蛋白2.0 g GB/T 31802-2015 5 GB/T 31802-2015 PVP(MW24 000.-.40 000) 20.0 g 叠氨铀(a3)0.2 g 4C储存。B.1.8 底物缓冲镀(pH9.8) 二乙酶胶97 mL 氧化模(MgClz)0.1 g 叠氟铀(a3)0.2 g 溶于800mL蒸馆水中，用盐酸调pH至9.8，然后用蒸馆水定容至1L. 4 c储存。B.2 试验步骤B.2.1 包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀挥包被抗体，每孔加100L。酶联
12、板加盖或用保鲜膜包好，放在37C孵青2h .清空孔中榕液，用PBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。B.2.2 样晶制备和加梓待测样品按1: 10(质量=体积加入抽提缓冲液，在研钵中研磨，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检翻样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。向酶联板中加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100L/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在4C膊育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3min B.2.3 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲撞，按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中.1
13、00L/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在37C孵育4h。酶联板用自来水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3 min. B.2.4 加底物将底物pPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)，100L/孔加人到酶联板中，室温避光辉育。B.2.5 读数在不同的时间内如30min、60min, 90 min、120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3 结果判定对照孔的OD值(蟹冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔应该在质量控制范围内，即z缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值5;同一样品的重复性基本一致。在满足了上述的质量要求后，结果原则上可判断如下z样品00.值/阴性对照
14、OD405值明显2.判为阳性F样品OD值/阴性对照OD405值在2左右时，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证，样晶OD405值/阴性对照OD405值明显2.判为阴性。若满足不了上述的质量要求，则不能进行结果判断。6 C.1 试剂C.1.1 试剂核酸提取试剂为TRlzol试剂。C. 1.2 TAE摄冲波40 mmol/L Tris-HAc, 1 mmol/L EDTA. pH 8.0。C.1.3 6 x加样缓冲撞0.25%澳酣蓝p40%质量分数蘸糖水溶液。C. 1.4 引物序列附录C规范性附录)RT耐R栓现GB/T 31802-2015 所扩增的序列片段来自TSWV的NP基因(Ge
15、neBankAccession No. JQ692106.1)，长度为441bp. 引物序列如下zTSWV-F: 5仁AGGATTGGAGCCACTGAC-3(位置226nt243 nt) TSWV-R; 5 GCTGGAGCTGAGTATAGCAG-3 (位置647nt666 nt) C.2 试验步骤C.2.1 总RNA提取取0.1g样品，液氮研磨成粉末状，加人1mL TRlzol试剂，混匀，倒人1.5mL离心管中。在4C以12000 r/min离心5min，将上清液移入一新离心营中。加入0.2mL三氯甲烧，剧烈振荡15s，在4C 以12000r/min离心15min.小心吸取上层元色水相到
16、新离心管中，加入等体Jt预冷异丙醇，颠倒混匀，一20C静置10min.在4C以12000r/min离心10min，倒掉上清液，保留沉淀。加人1mL 70% 预冷乙障，悬浮沉淀，在4C以12000 r/min离心10min。倒掉乙醇，待沉淀充分干燥后，加入20LDEPC水榕解沉淀，存于一80C备用。C.2.2 反转录反应按表C.l配制反转录反应体系20L。反转录反应条件为:25 C 10 min, 50 C 30 min, 85 C 5 min. 7 GB/T 31802 2015 表C.l反转录反应体系名称储存浓浓度加样量/L终浓度反应缓冲液2X 10.0 1X Random Primer 0
17、.1glL 1.0 0.00581L RNA模板3.0 反转录酶20X 1.0 1X 补水至20.0 C.2.3 PCR扩增按表C.2配制PCR反应体系20L.反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含TSWV的植物材料的DNA或含有TSWV目标片段的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替DNA模板作为空白对照。PCR反应条件:94C 5 min;94 C 30 s, 53 C 30 s, 72 c 30 8，35个循环，72C 5 min延伸。表C.2PCR反应体系名称储存液浓度加样量/L终浓度PCR缓冲液10X 2.0 1X dNTP 10
18、 mmollL 1.0 0.5 mmollL 上游引物20mol/L 0.4 0.4 p.mol/L 下游引物20mol/L 0.4 0.4mOl/L Taq酶5 UIL 0.2 0.05 UIL DNA模板2.0 补水至20.0 C.2.4 琼脂糖凝肢电豫幢测用1XTAE配制1%琼脂糖凝肢，加热溶化后冷却至55C左右。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加人1XTAE，缓冲撞要没过凝胶表面约1mm. 将加样缓冲撞与样品提合后加入样品孔，同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加人DNA相对分子质量标准物。接通电源，以3V/cm5 V/cm电场强度进行电泳，0.5h后
19、观察结果。电泳结束后，将凝肢放人0.5g/mL的澳化乙健(EB)染色液中染色10min 15 min.将整个凝胶置于凝肢成像系统上观察，记录结果。C.3 结果判定如果阳性对照出现约441坤的条带，检测样晶、阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为阴性。如果阳性对照及检测样品出现约441bp的条带，阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为阳性。8 GB/T 31802-2015 附最D规范性附最实时提光RT-PCR检测方法D.1 试剂D. 1. 1 RNA提取试剂TRIzol试剂、三氯甲烧、异丙醋、70%乙靡。D.1.2 试剂Taq Man One-Step RT-PCR Mixture.
20、D.1.3 引物和探针所扩增的序列片段来自TSWV的NP基因(GeneBankAccession No. JQ692106.口，引物和探针序列如下:引物序列:TSWV-F:5-CTC TTG ATG ATG CAA AGT CTG TGA-3 (位置398nt.421 nt) SWV-R: 5-TCT CAA AGC TAT CAA CTG AAG CAA TAA-3 (位置455nt.481 nt) 探针序列ITSWV-P:5-FAM-AGG TAA GCT ACC TCC CAG CAT TAT GGC AAG-BHQl-3 (位置424nt.453 nt) D.2 试验步骤D.2.1 总
21、RNA提取操作方法见C.2.1.D.2.2 实时荧光RT町PCR反应实时荧光RT-PCR反应体系见表D.l.检测时以含TSWV的植物材料的RNA作为阳性对照s以健康植物材料作为阴性对照z以水代替RNA模板作为空白对照。表D.1实时荧光RT-PCR反应体系名称贮备液浓度加样量/L终浓度RT-PCR缓冲液2X 12.5 lX TSWV-F 20mol/L 0.5 0.4mol/L TSWV-R 20mol/L 0.5 0.4mol/L TSWV-P 10mol/L 0.5 0.2mol/L RNA模板2.0 RT-PCR Enzyme Mix 25X 1.0 lX 补水至25.0 9 GB/T 3
22、1802-2015 反应条件:48C 30 min, 95 C 10 min，然后95C 15 5 , 60 C 1 min，共40个循环。点击运行，进行PCR反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出Rn(荧光信号增加值)与循环数之间关系的图像。D.3 结果判定在阳性对照Ct值小于30，水空白对照Ct值大于或等于40的条件下(若不满足该两项条件，此次检测无效，应重做荧光PCR扩增): a) 待测样品的Ct值等于40时，则判定棒品为阴性.b) 待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定样品为阳性。c) 待测样品的Ct值大于35而小于40时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值等于4
23、0时，则判定样品为阴性。如果重新测试的Ct值小于40时，则判定样品为用性。10 E.1 试材E.1.1 鉴别寄主附录E(资抖性附最生物学测定GB/T 31802-2015 黄瓜(Cucumissativus)、矮牵牛(Petuniahy加ida)、克利夫兰烟(Nicotiananclevelandii)、心叶烟 (Nicotiana glutinosa)、普通烟(Nicotianatabacum)、黄花烟(Nicotianarustica)、曼陀罗(Daturastra monium)、番茄(Lycoersiconesculentum)、本生烟(Nicotianabenthamiana)。E.
24、1.2 试剂接种缓冲液10.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，含0.001mol/L EDTA(乙二股四乙酸二铺), 0.005 mol/L DIECA(二乙基二硫代氨基甲酸销)，0.1%就基乙蹲使用时加入E.2 方法E.2.1 机械接种方法E.2.1.1 研磨病样加1: 5(质量=体积的磷酸盐缓冲液，在研钵中研碎.研碎后放人硅藻土或金刚砂，浓度为0.5%，与病汁液混匀。E.2.1.2 接种用于将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面。E.2.1.3 冲洗用自来水冲洗叶表面。E.2.2 面马自然传播在具有隔离的条件下，可采用葫马进行自然传播。E.2.3 观察每天观察记载寄主反应，连续观察1个月.E.3 鉴别寄主症状E.3.1 黄瓜z子叶上表现有坏死中心的褪绿斑，无系统侵染E.3.2 矮牵牛z局部坏死斑。E.3.3 克利夫兰烟、心叶烟、普通烟、黄花烟z局部坏死斑，系统坏死症状和叶畸形。的FON|NOFmH筒。GBjT 31802-2015 曼陀罗z接种叶褪绿斑和坏死斑，系统花叶和斑驳。番茄z接种叶褪绿到坏死斑和环，系统花叶、系统褪绿和坏死斑。本生烟s系统花叶症状，新生叶扭曲、畸形.E.3.6 E.3.4 E.3.5 , 侵权必究版权专有 书号:155066 1-49517 定价g18.00元31802-2015
