1、B 04ICS 65.020.01 天 津 市 地 方 标 准 DB12DB12/T 5062014 大豆转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified soybean 2014-04-22发布 2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5062014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由天津市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人：黄凤军、陈杰、朱珠、李建、马强、赵新、龙起成、陈慧。 本标准20
2、14年04月首次发布。 DB12/T 5062014 1 大豆转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了大豆中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。 本标准适用于大豆及其制品中Lectin内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基因、Bt基因和bar/pat基因的定性PCR筛查检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产
3、品检测 通用要求 农业部2031号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 农业部1485号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Lectin基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。 3.2 CaMV 35S启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV） 来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。 3.3 NOS终止子 terminator of nopaline synthase （NOS） gene 来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。 3.4
4、 CP4-epsps基因 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene derived from Agrobacterium sp. CP-4。 来源于土壤农杆菌株系 （Agrobacterium sp.） CP4株系一段可编码5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的基因。 3.5 Bt基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene 来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因
5、。 3.6 bar/pat基因 bialaphos resistance gene/phosphinothricin acetyltransferase gene DB12/T 5062014 2 bar 基因来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），pat 基因来源于绿产色链霉菌（Streptomyces viridochromogens），均编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricin acetyltransferase，PAT），该酶具有对除草剂草丁膦（glufosinate）的耐受性。bar基因和pat基因具有较高的同源性。 4 检测方法
6、4.1试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1.2 琼脂糖。 4.1.3 10 g/L溴化乙锭溶液：称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶于100 mL水中，避光保存。 注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.4 10 mol/L氢氧化钠溶液：在160 mL水中加入80.0 g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200 mL。 4.1.5 500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），
7、加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（4.1.4）调pH至8.0，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121 ）条件下灭菌20 min。 4.1.6 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（121 ）条件下灭菌20 min。 4.1.7 TE缓冲液（pH 8.0）：分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（1
8、21 ）条件下灭菌20 min。 4.1.8 50TAE缓冲液：称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1 000 mL。使用时用水稀释成1TAE。 4.1.9 加样缓冲液：称取250.0 mg溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解12 h；称取250.0 mg二甲基苯腈蓝，用10 mL水溶解；称取50.0 g蔗糖，用30 mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100 mL，在4 下保存。 4.1.10 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bp1 000 bp的D
9、NA片段。 4.1.11 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。 4.1.12 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25 mmol/L氯化镁溶液。 4.1.13 引物：大豆内标准基因和转基因大豆外源基因检测时所用的引物序列见表1。 表1 大豆内标准基因和转基因大豆外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 Lectin lec-1672F：5-GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG-3 lec-1881R：5-GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG-3 210 bp 内标准基因 Ca
10、MV 35S 35S-F：5-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 35S-R：5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS-F：5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS-R：5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因 DB12/T 5062014 3 CP4-epsps mCP4ES-F：5- ACGGTGAYCGTCTTCCMGTTAC -3 mCP4ES-R：5- GAACAAGCARGGCMGCAACCA -3 333 bp 外源基因 Bt Bt-F：5- GAAGGTTTG
11、AGCAATCTCTAC -3 Bt-R：5- CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3 301 bp 外源基因 bar bar-F：5- GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 bar-R：5- CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 262 bp 外源基因 pat pat-F：5- GAAGGCTAGGAACGCTTACGA -3 pat-R：5- CCAAAAACCAACATCATGCCA-3 262 bp 外源基因 4.1.14 引物溶液：用TE缓冲液（4.1.7）或水分别将上述引物稀释到10 mol/L。 4.1.15 石蜡油。 4.1.16 PCR产物回收试剂
12、盒。 4.1.17 DNA提取试剂盒。 4.2 仪器 4.2.1 分析天平：感量0.1 g 和0.1 mg。 4.2.2 PCR扩增仪：升降温速度1.5 /s，孔间温度差异1.0 。 4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 4.2.4 紫外透射仪。 4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。 4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。 4.2.7 其他相关仪器设备。 4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按NY/T 672 和农业部2031号公告192013规定的执行。 4.3.2 试样准备 按NY/T 672 和农业部2031号公告192013规定的执行。 4.3.3 试样预处理 按农业部1485号公告4
13、2010规定的执行。 4.3.4 DNA模板制备 按农业部1485号公告42010规定的执行。 4.3.5 PCR反应 4.3.5.1 试样PCR反应 4.3.5.1.1 每个试样PCR反应设置3次重复。 4.3.5.1.2 在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，混匀，再加25 L石蜡油（有热盖设备的PCRDB12/T 5062014 4 仪可不加）。 表2 PCR检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs混合溶液（各2.5 mmol/L） 各0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol
14、/L上游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L 10 mol/L下游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L Taq酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 根据Taq酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0 L。如果PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积水。 注1：大豆内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别为lec-1672F和lec-1672R，引物终浓度分别为0.2mol/L；CaMV35S启动子PCR检测反应体系中，上下游引物分别是35S-F和35S-
15、R，引物终浓度分别为0.4mol/L；NOS终止子PCR检测反应体系中，上下游引物分别是NOS-F和NOS-R，引物终浓度分别为0.4mol/L；CP4-epsps基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是mCP4ES-F和mCP4ES-R，引物终浓度分别为0.2mol/L；Bt 基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是Bt-F和Bt-R，引物终浓度分别为0.5mol/L；bar基因和pat基因复合PCR检测反应体系中，上游引物分别是bar-F和pat-F，下游引物分别是bar-R和pat-R，引物终浓度分别为0.1mol/L。 4.3.5.1.3 将PCR管放在离心机上，500 g3 00
16、0 g离心10 s，然后取出PCR管，放入PCR扩增仪中。 4.3.5.1.4 进行PCR反应。反应程序按表3进行。 表3 PCR反应程序 基因名称 变性 扩增 循环次数 最终延伸 Lectin 94 ，5 min 94 ，30 s 58 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min CaMV35S 94 ，5 min 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min NOS 94 ，5 min 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min CP4-epsps 95 ，7 min 94 ，30 s 63 ，30 s 72
17、 ，30 s 5 72 ，7 min DB12/T 5062014 5 94 ，30 s 60 ，30 s 72 ，30 s 32 Bt 95 ，5 min 94 ，1 min 56 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min bar /pat 95 ，5 min 94 ，30 s 63 ，30 s 72 ，30 s 35 72 ，7 min 4.3.5.1.5 反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。 4.3.5.2 对照PCR反应 在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。 以非转基因大豆基因组 DNA 作为阴性对照；以含有 CaMV35S、NO
18、S、CP4-epsps、Bt、bar/pat基因的转基因大豆质量分数为0.1%1.0%的基因组DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。 各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与4.3.5.1相同。 4.3.6 PCR产物电泳检测 按20 g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100 mL琼脂糖溶液中加入5 L EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12 L PCR产物与3 L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接
19、通电源在2 V/cm5 V/cm条件下电泳检测。 4.3.7 凝胶成像分析 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统或紫外透射仪上成像。根据 DNA 分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的规定执行。 4.3.8 PCR产物回收 按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。 4.3.9 PCR产物测序验证 将回收的PCR产物克隆测序，与大豆内标准基因Lectin、CaMV35S、NOS、CP4-epsps、Bt、bar/pat基因序列（参见附录A）进行比对，确
20、定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。 5 结果分析与表述 5.1 对照检测结果分析 阳性对照的PCR反应中，内标准基因和外源基因均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出内标准基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常。否则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。 DB12/T 5062014 6 5.2 样品检测结果分析和表述 5.2.1 在试样的 PCR 反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；而CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、bar/pat基因和CP4-epsps基因均未得到扩增，或扩增片段
21、大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因成分。结果表述为“试样中未检测出CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、bar/pat基因和CP4-epsps基因，检测结果为阴性”。 5.2.2 在试样PCR反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、bar/pat基因和CP4-epsps基因中任何一个得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出转基因成分。结果表述为“试样中检测出XXX，检测结果为阳性”。 DB12/T 5062014 7 附录A （资料性附录） A.1 Lectin基因PCR扩增产物核苷
22、酸序列 1 GGGTGAGGAT AGGGTTCTCT GCTGCCACGG GACTCGACAT ACCTGGGGAA TCGCATGACG 61 TGCTTTCTTG GTCTTTTGCT TCCAATTTGC CACACGCTAG CAGTAACATT GATCCTTTGG 121 ATCTTACAAG CTTTGTGTTG CATGAGGCCA TCTAAATGTG ACAGATCGAA GGAAGAAAGT 181 GTAATAAGAC GACTCTCACT ACTCGATCGC 注：划线部分为引物序列 A.2 CaMV 35S启动子PCR扩增产物核苷酸序列 1 GCTCCTACAA
23、 ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCTAT CATTCAAGAT GCCTCTGCCG 61 ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC 121 CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATACTTC CACTGACGTA AGGGATGACG 181 CACAATCCCA CTATC 注：划线部分为引物序列 A.3 NOS终止子PCR扩增产物核苷酸序列 1 GAATCCTGTT GCCGGTCTTG CGATGATTAT CATATAATTT CTG
24、TTGAATT ACGTTAAGCA 61 TGTAATAATT AACATGTAAT GCATGACGTT ATTTATGAGA TGGGTTTTTA TGATTAGAGT 121 CCCGCAATTA TACATTTAAT ACGCGATAGA AAACAAAATA TAGCGCGCAA ACTAGGATAA 注：划线部分为引物序列 A.4 CP4-epsps基因PCR扩增产物核苷酸序列一 1 ACGGTGACCG TCTTCCCGTT ACCTTGCGCG GGCCGAAGAC GCCGACGCCG ATCACCTACC 61 GCGTGCCGAT GGCCTCCGCA CAGGTGAA
25、GT CCGCCGTGCT GCTCGCCGGC CTCAACACGC 121 CCGGCATCAC GACGGTCATC GAGCCGATCA TGACGCGCGA TCATACGGAA AAGATGCTGC 181 AGGGCTTTGG CGCCAACCTT ACCGTCGAGA CGGATGCGGA CGGCGTGCGC ACCATCCGCC 241 TGGAAGGCCG CGGCAAGCTC ACCGGCCAAG TCATCGACGT GCCGGGCGAC CCGTCCTCGA 301 CGGCCTTCCC GCTGGTTGCG GCCCTGCTTG TTC 注：划线部分为引物序列 A
26、.5 CP4-epsps基因PCR扩增产物核苷酸序列二 1 ACGGTGATCG TCTTCCAGTT ACCTTGCGTG GACCAAAGAC TCCAACGCCA ATCACCTACA 61 GGGTACCTAT GGCTTCCGCT CAAGTGAAGT CCGCTGTTCT GCTTGCTGGT CTCAACACCC 121 CAGGTATCAC CACTGTTATC GAGCCAATCA TGACTCGTGA CCACACTGAA AAGATGCTTC 181 AAGGTTTTGG TGCTAACCTT ACCGTTGAGA CTGATGCTGA CGGTGTGCGT ACCATC
27、CGTC 241 TTGAAGGTCG TGGTAAGCTC ACCGGTCAAG TGATTGATGT TCCAGGTGAT CCATCCTCTA DB12/T 5062014 8 301 CTGCTTTCCC ATTGGTTGCT GCCTTGCTTG TTC 注：划线部分为引物序列 A.6 Bt基因PCR扩增产物核苷酸序列 1 GAAGGTTTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT 61 CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCG
28、CC 121 TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGTC CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG 181 TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA 241 AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATC 301 G 注：划线部分为引物序列 A.7 bar基因PCR扩增产物核苷酸序列 1 GAAGGCACGC AACGCCTACG ACTGGACGGC CGAGTCGACC G
29、TGTACGTCT CCCCCCGCCA 61 CCAGCGGACG GGACTGGGCT CCACGCTCTA CACCCACCTG CTGAAGTCCC TGGAGGCACA 121 GGGCTTCAAG AGCGTGGTCG CTGTCATCGG GCTGCCCAAC GACCCGAGCG TGCGCATGCA 181 CGAGGCGCTC GGATATGCCC CCCGCGGCAT GCTGCGGGCG GCCGGCTTCA AGCACGGGAA 241 CTGGCATGAC GTGGGTTTCT GG 注：划线部分为引物序列 A.8 pat基因PCR扩增产物核苷酸序列 1 GAAGG
30、CTAGG AACGCTTACG ATTGGACAGT TGAGAGTACT GTTTACGTGT CACATAGGCA 61 TCAAAGGTTG GGCCTAGGAT CCACATTGTA CACACATTTG CTTAAGTCTA TGGAGGCGCA 121 AGGTTTTAAG TCTGTGGTTG CTGTTATAGG CCTTCCAAAC GATCCATCTG TTAGGTTGCA 181 TGAGGCTTTG GGATACACAG CCCGGGGTAC ATTGCGCGCA GCTGGATACA AGCATGGTGG 241 ATGGCATGAT GTTGGTTTTT GG 注：划线部分为引物序列
