1、ICS 65.020.01 B 05 DB33 浙江省地方标准 DB 33/T 9632015 厚皮甜瓜 种子纯度 分子标记 鉴定方法 Purity identification of Musk melon variety using molecular marker analysis 2015 - 05 - 07 发布 2015 - 06 - 07 实施 浙江省质量技术监督局 发布DB33/T 9632015 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草 。 本标准 由浙 江省 农业 厅提 出。 本标准 由浙 江省 种植 业标 准化技 术委 员会 归口 。 本标准
2、起草 单位 ：宁 波市 农业科 学研 究院 、宁波市 种植业 管理 总站 。 本标准 主要 起草 人： 宋慧 、王毓 洪 、 张香 琴 、 臧全 宇 、陆惠斌 、张庆 、 范雪 莲。 DB33/T 9632015 1 厚 皮甜瓜 种子纯度 分子标 记鉴定方 法 1 范围 本标准 规定 了厚 皮甜 瓜种 子纯度 分子 检测 方法 的术 语与定 义、 原理 、 试 剂、 仪 器设备 、 操 作步 骤 和 样品纯 度判 定与 计算 。 本标准 适用 于厚 皮甜 瓜种 子纯度 鉴定 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的 。 凡是注 日期的 引用 文件 ， 仅所
3、注 日期的 版本 适用 于本文 件。凡 是不 注日 期的 引用 文件， 其最 新版 本（ 包括 所有的 修改 单） 适用 于本 文件。 农业部1485 号公 告-4-2010 转基 因植 物及 其 产 品成 分检测 DNA 提取和 纯化 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。 3.1 品种纯 度 品种在特征 特性方 面典型一 致的程度 ，用本 品种的种 子数占供 检本作 物样品种 子数的百 分率表 示 GB/T 3543.5-1995 ，定 义3.2。 3.2 杂株 某差异 位点 杂交 失败 ，该 位点纯 合的 单株 。 3.3 杂种一 代 某差异 位点 杂交 成功 ，该 位
4、点杂 合的 单株 。 3.4 显性标 记位 点 仅能检 测显 性等 位基 因， 不能够 区分 纯合 和杂 合基 因型的 遗传 标记 位点 。 3.5 共显性 标记 位点 DB33/T 9632015 2 同时能 检测 出显 性和 隐性 等位基 因， 能够 区分 纯合 和杂合 基因 型的 遗传 标记 位点。 3.6 随机扩 增多 态 性DNA 标记 （RAPD ） 以基因 组DNA 为模板 ，以 单 个人工 合成的 随机 多态核 苷酸序 列（通 常为10 个碱 基对） 为引物 ，在 热 稳定的Taq DNA 聚合 酶作 用下， 进行PCR 扩增。 扩增 产 物经琼 脂糖 电泳 分离、 溴 化乙锭
5、 染色 后， 在 紫外 透 视仪上 检测 多态 性。 3.7 简单重 复序 列标 记（SSR ） 根据真 核生 物中 广泛 存在 的简单 重复 序列 两端 的互 补保守 区域 设计 引物 。 由 于 核心序 列串 联重 复 数 目不同 ，PCR 扩增后 获得 的 产物长 度不同 ，通 过高分 辨率琼 脂糖凝 胶电 泳分离 、溴化 乙锭染 色后 ，在 紫 外透视 仪上 检测 多态 性。 4 原理 从厚皮 甜瓜 幼苗 新叶 中提 取基因 组DNA ， 利用 分子 标 记进行PCR 扩增 ， 扩增产 物在琼脂 糖凝 胶的 分子 筛效应 和电 泳分 离的 电荷 效应作 用下 进行 分离 。 通 过溴化
6、 乙锭 （EB ） 染色， 在紫外光 下发 出荧 光显 示核 酸谱带 差异 。不 同厚 皮甜 瓜品种 由于 遗传 组成 不同 ，引物 结合 后扩 增产 物不 同，出 现扩 增产 物有 和 无 、 或者扩 增片 段大 小不 同的 差异。 这些 差异 可利 用电 泳图谱 加以 鉴别 ，从 而对 种子纯 度进 行鉴 定。 5 试剂 除非另 有说 明， 仅使 用分 析纯试 剂和 去离 子水 。 5.1 引物 5.1.1 RAPD RAPD（ Random Amplified Polymorphic DNA） 引物 名称、 序列 及差 异片 段大 小见表1。 表1 RAPD 引物 名称 、序 列及 差
7、异片段 大小 名称 序列（5-3） 差异片段大小（bp） RAPD-1 ACCTGGACAC 1200/1400 RAPD-2 CCACATCGGT 1200/1300 RAPD-3 ACACCGGAAC 1500 RAPD-4 CCGAACACGG 460/550 5.1.2 SSR SSR（Simple Sequence Repeat） 引物 名称 、序 列及 差异片 段大 小见 表2 。 DB33/T 9632015 3 表2 SSR 引 物名 称、 序列 及差 异片段 大小 名称 F- 序列（5-3） R- 序列（5-3） 差异片段大小（bp） SSR-1 CAAAGGGCTACAAT
8、AAC CATCATAATCACCCTATCTC 225/350/400/450 SSR-2 CAGCTCTACAACAACATCTC ATCCAACTCGACCAAGAAAC 120/130/140/550/600 SSR-3 TGAAGAGACTACCATCCCCA TTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC 140/150/320/350 5.2 琼脂糖 5.2.1 RAPD 使用2% 普通标 准凝 胶琼脂糖 （DNA 片段分 离范 围 500 bp 20000 bp）。 5.2.2 SSR 使用 2.5%高 分辨 率标 准凝胶 琼脂 糖（DNA 片段 分离范 围40 bp 1000
9、bp ）。 5.3 10 g/L 溴化乙 锭溶 液 称取1.0 g 溴化 乙锭 （EB ） ，溶于100 mL水中。 配制 和使用 时应 戴一 次性 手套 操作并 妥善 处理 废液。 5.4 10 mol/L 氢氧 化钠 溶液 称取80.0 g 氢氧 化钠 （NaOH ）， 先用160 mL水溶解 后，再加 水定 容到200 mL。 5.5 0.5 mol/L 乙二 胺四 乙酸 二钠溶 液（pH 8.0） 称取18.6 g 乙二胺 四乙 酸二钠（EDTA-Na2 ）， 加入70 mL 水中 ，再 加入2 g 氢氧 化钠， 加热 至完 全溶 解后，冷却至室温，用按 本标准5.4 配置氢氧化钠 溶
10、液调pH 至8.0 ，加水定 容至100 mL 。在103.4 kPa （121 ） 条件 下灭 菌20 min。 5.6 1 mol/L 三羟甲 基氨 基甲 烷-盐酸溶 液（pH 8.0 ） 称取121.1 g 三羟 甲基 氨基 甲烷（Tris ）溶 解于800 mL水中 ，加 入42 mL 盐酸 ， 搅拌均 匀。 用盐 酸调 pH至8.0 ，加水 定容 至1000 mL。在103.4 kPa（121 ）条 件下 灭菌20 min。 5.7 TE 缓冲液 （pH 8.0 ） 分别量 取10 mL 按本 标准5.6 配置 的 三羟甲 基氨 基甲 烷-盐酸 溶液 和2 mL按本标 准5.5配置的
11、 乙二 胺四 乙酸二 钠溶 液， 加水 定容 至1000 mL 。在103.4 kPa （121 ） 条件 下灭 菌20 min。 5.8 5TBE 缓冲液 称取54 g 三羟甲 基氨 基甲 烷，27.5 g 硼酸 ，先 用500 mL水加热 搅拌 溶解 后， 加入20 mL按本标 准5.5 配置的 乙二 胺四 乙酸 二钠 溶液， 加水 定容 至1000 mL 。使用 时用 水稀 释成0.5TBE。 5.9 加样缓 冲液 称取1 g 水溶 性钠型 溴酚 蓝于100 mL水中 ，涡 旋直到 完全溶 解，配 制成0.15% 溴 酚蓝。 称取1 g二甲 基苯腈 蓝于 足量 水中 ， 定 容到100
12、mL，配制 成0.15% 二甲基 苯腈 蓝。 分别取1.5 mL的0.15% 溴酚 蓝和0.15% 二甲基 苯腈 蓝， 加入100 L按本 标准5.5 配置的 乙二 胺四乙 酸二 钠溶 液， 再加 入4 g蔗糖， 加水 定容 至10 mL。在4保存 。 5.10 DNA 分子量 标准 5.10.1 对于RAPD ，选 择能 够清 楚地区 分 100 bp 2000 bp 的 DNA 片段 的 DNA 分 子量 标准。 DB33/T 9632015 4 5.10.2 对于SSR ，选择 能够 清楚 地区 分 50 bp1500 bp 的 DNA 片段 的 DNA 分 子量 标准。 5.11 dN
13、TPs 混合 溶液 将浓度 为2.5 mmol/L 的dATP 、dTTP、dGTP 、dCTP四种脱氧核 糖核 苷酸 等体 积混 合。 5.12 Taq DNA 聚合酶 及 PCR 反 应缓冲 液。 将Taq DNA 聚合 酶配 制成5 U/ L使用。 6 仪器设 备 6.1 电子天 平： 感量 0.01 g 。 6.2 PCR 扩增仪 。 6.3 电泳仪 、电 泳槽 等电 泳装 置。 6.4 凝胶成 像系 统。 6.5 其他分 子生 物学 实验 室仪 器设备 。 7 操作步 骤 7.1 抽样 厚皮甜 瓜种 子按 照每 批次 不少于300 粒抽 样。 7.2 取样 抽样结 束后 ，播 种，
14、待第 一片真 叶长 至0.5 cm 1 cm 时， 即可 单株 取真 叶样 品，液氮 冷冻 研磨 。 7.3 DNA 模板制 备 按农业 部1485号公告-4-2010 规定 执行 。 7.4 PCR 反应 7.4.1 每个试 样PCR 反 应设 置三 次重复 7.4.2 在PCR 反应 管中 按 照表 3 和表4 依次 加入 反应 试剂 ，用手 指轻 弹混 匀。 表3 RAPD 的 PCR 检测反 应体 系 试剂 终浓度 体积（L ） 无菌水 / 2.57 2.5 mmol/L dNTP 0.25 mmol/L 1.0 10buffer 1 1.0 25 mmol/L MgCl2 2.5 m
15、mol/L 1.0 引物5 mmol/L 0.5 mmol/L 1.0 5 U/ L Taq 酶 0.015 U/ L 0.03 10 ng/L 模板DNA 3.4 ng/ L 3.4 总体积 / 10 DB33/T 9632015 5 表4 SSR 的PCR 检测 反 应体系 试剂 终浓度 体积（L ） 无菌水 / 2.46 2.5 mmol/L dNTP 0.2 mmol/L 1.2 10 buffer 1 1.5 25 mmol/L MgCl2 3 mmol/L 1.8 上游引物5 mmol/L 0.5 mmol/L 1.5 下游引物5 mmol/L 0.5 mmol/L 1.5 5 U
16、/ L Taq 酶 0.0133 U/L 0.04 10 ng/L 模板DNA 3.33 ng/L 5 总体积 / 15 7.4.3 进行PCR 反应。RAPD 反应 程序为：94预变 性 4 min，进 行 40 次循环 扩增 反应 （93 变 性 15 s ， 40退 火 30 s ，72延伸 2 min。 根据 不同 型号 的 PCR 仪， 可 将 PCR 反应的 退火 和延伸 时间 适当 延长 ） ； 72延 伸 6 min。SSR 反应 程序为 ：94 预 变性 1 min，进行 40 次循环 扩增 反应 （93变性 1 min，40 退火1 min ，72 延 伸 1 min。根
17、据不 同型 号的 PCR 仪，可 将 PCR 反 应的 退火 和延伸 时间 适当 延长 ）； 72延 伸 1 min 。 7.4.4 反应结 束后 取出 PCR 反应 管，加 入加 样缓 冲液 ，对PCR 反应产 物进 行电 泳检 测。 7.5 PCR 产物 电泳 检测 7.5.1 按 20 g/L 和 25 g/L 的浓 度， 分别 称取 普通 琼脂 糖和 高分辨 率琼 脂糖 ， 加入 0.5TBE 缓冲 液中 ， 加热溶 解， 配制成 琼脂 糖溶液 。 按每 100 mL 琼脂 糖溶液中 加入 5 L EB 溶液 的比例加 入 EB 溶液， 混匀 ， 冷却 至 60 左 右， 将凝 胶 溶
18、液轻 缓倒 入电 泳胶 板中 ，插上 梳子 ，静 置冷 却30 min 以上 。在 盛有0.5 TBE 缓 冲液 的电 泳槽 中， 垂直向 上轻 轻拔 去梳 子。 7.5.2 PCR 反应管 取 7 L PCR 产物与 2 L 加样 缓冲 液混 合 后加入 凝胶 点样 孔， 同时 在其中 一个 点样 孔中加 入DNA 分子量 标准 ，接通 电源 ，在 200 A 电流、90 V 电压 条件 下电 泳2 h3 h ，待加 样缓 冲液 中的溴 酚蓝 距离 点样 孔 4 cm 5 cm 时， 停止 电泳 。 7.6 凝胶成 像分 析 电泳结 束后， 取出 琼脂糖 凝胶， 置于凝 胶成 像仪或 紫外投
19、 射仪上 成像 。根据DNA 分子 量标准 估计 扩 增条带 的大 小， 将电 泳结 果形成 电子 文件 存档 或用 照相系 统拍 照。 8 样品纯 度判 定与 计算 8.1 杂种一 代样 品纯 度判 定 8.1.1 标记的 差异 位点 显示 共显 性，供 试材 料的 带型 与杂 种一代 双亲 之一 相同 ，则 表明该 材料 在差 异 位点杂 交不 成功 ，判 断为 杂株； 同时 具有 杂种 一代 双亲差 异条 带的 供试 材料 确定为 杂种 一代 。 8.1.2 标记的 差异 位点 显示 显性 ，供试 材料 在差 异位 点缺 失，表 明该 材料 在该 差异 位点杂 交不 成功 ， 判断为 杂株 ；差 异位 点有 扩增条 带的 供试 材料 ，不 做杂种 一代 或者 杂株 的判 定。 8.2 常规种 样品 纯度 判定 DB33/T 9632015 6 供试材 料在 标记 差异 位点 的扩增 结果 与常 规种 的不 相同， 则判 断为 杂株 。 8.3 样品纯 度计 算 样品纯 度按 照下 列公 式计 算： - 100% = 供检种子粒数（幼苗数）杂株种子 粒数（幼苗数） 品种纯度 供检种子粒数（幼苗数）
