1、ICS 65.020.30B41DB41河南省地方标 准DB 41/T 15152017猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 检测方法2017-12-06发布 2018-03-06河南省质量技术监督局发布DB41/T 15152017I前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局归口。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，郑州市畜牧技术推广站，焦作市动物疫病预防控制中心,驻马店市动物疫病预防控制中心、开封市动物卫生监督所、郑州市中心医院。本标准主要起草人：崔沛、班付国、闫若潜、曹伟伟、马震原、陈悦、王淑娟。本标准参加起草人：王英华、谢彩华、王翠、王华俊、赵胜杰、赵
2、明军、王东方、郭育培、张敏、杨晴、张煜、刘先敏、靳冬、刘淑敏。DB41/T 151520171猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 检测方法1范围规定了猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 检测的试剂和仪器设备,样品采集、处理、存及运输,操作方法、结果判定。适用于对疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、血液，精液，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等样品中病毒核酸的检测。2 试剂和仪器设备2.1 试剂2.1.1 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取 RNA 所用试剂应使用无 RNA 酶污染的容器进行分装。2.1.2 组织悬液（见附录 A），-20 保存。2.1.3 裂解液（ TriZol），氯仿， 1核酸电泳缓冲液，
3、0.01 mol/L（ pH 7.2）的 PBS（见附录 A）， DEPC处理水（见附录 A），以上试剂 4保存。2.1.4 组织样品悬液常规试剂（见附录 A）常温保存。2.1.5 裂解液（TriZol ），氯仿， 0.01 mol/L（pH 7.2）PBS （见附录 A），DEPC 水（二乙基焦碳酸酯处理的水），均应 2 -8 保存。2.1.6 异丙醇，75 % 乙醇，应-20 保存。2.1.7 阳性对照样品、阴性对照样品见附录 A。2.1.8 RT-PCR 扩增用上、下游引物序列见附录 B。2.1.9 猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 试验反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录 C。2.2
4、 仪器设备PCR 扩增仪，高速冷冻离心机（离心转速在 12 000 rmin-1 以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，生物安全柜，组织匀浆器， 2 8 冰箱， -70 冰箱，单道微量移液器（ 0.1 L2.5 L ；0.5 L10 L ；2L 20 L；20 L200 L ；100 L 1000L ）凝胶成像系统( 或紫外透射仪) ，真空干燥器。3 样品的采集、处理、存放及运输3.1 样品的采集DB41/T 1515201723.1.1 采取疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎及公猪精液等靶组织样品，装入灭菌 1.5 mL 离心管中，编号，送实验室。3.2 样品的处
5、理3.2.1 组织样品处理：取 100 mg 待检样品，按 1:5 倍体积加入 PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000r/min 离心 15 min，取上清液，转入 1.5 mL 离心管中编号备用。3.2.2 血清样品的处理：用无菌注射器自耳静脉采集血液 1-2 mL，把血清析出后直接转入新的无菌 1.5mL 离心管中，编号备用。3.3 存放与运输采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在 2 8 条件下保存应不超过 24 h；若超过 24 h，应放置低于-20 冰箱，不宜反复冻融。4 操作方法4.1 样品 RNA 的制备4.1.1 取 1.5 mL 灭菌离
6、心管，每管加入 300 L 裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各 100 L，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入 100 L 氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于 4条件下，12 000 r/min 离心 15 min。4.1.2 吸取离心后各管中的上清液 150 L 转移至新的 1.5 mL 灭菌离心管中（注意不要吸出中间层），加入 150 L 20 预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 15min。4.1.3 4条件下 12 000 r/min 离心 15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，将灭菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不
7、同无菌离心管应置于吸水纸不同地方沾干。加入 1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。4.1.4 4条件下 12 000 r/min 离心 5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将灭菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.5 4条件下 12 000 r/min 离心 30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干 3min5min或室温干燥 10 min。不宜过于干燥，以免 RNA 不易溶解。4.1.6 加入 11 L DEPC 处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，200
8、0r/min 离心 5s，冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2h 内进行 RT-PCR 扩增或放置于 70 冰箱备用。4.1.7 样品 RNA 制备可采用 4.1.14.1.6 提取方法，也可采用商品化的试剂盒提取。4.2 反转录（cDNA 的合成）配制反转录反应混合液，反转录反应混合液成份含：M-MLV 5Reaction buffer(含Mg2+)，4L；2.5mM dNTPs，4 L；M-MLV，0.5 L；RNA酶抑制剂，0.5 L；反转录引物（JEV-P2，也是RT-PCR反 应液中下游引物）1L；总体积10 L。向每管中分别加入4.1.6中相应RNA 10 L，并对每个管进行相应
9、的DB41/T 151520173编号，37 水浴1 h或置于PCR仪中37 1 h，反应结束后，70 15 min 灭活反转录酶，直接用于PCR扩增或-20 冻存备用。4.3 RT-PCR 扩增4.3.1 在检测区配制与 4.2 中相同数量的 RT-PCR 反应体系， PCR 反应混合液成分： 10PCR 缓冲液(含 Mg2+)， 2.5 L； 2.5mM dNTPs， 2L； JEV-P1， 0.5 L； JEV-P2， 0.5 L； Taq DNA 聚合酶， 0.25L ；水，15.25 L ；总体积为 21 L。4.3.2 向每个反应体系加入 4.2 中相应 cDNA 4 L，充分混匀
10、后使液体全部聚集于管底，并对每个管进行相应的编号。4.3.3 将 4.3.1 中加样后的 RT-PCR 反应管放入 PCR 扩增仪内。4.3.4 反应参数设置： 94 5min； 94 45 s， 52 45 s， 72 45 s 共 35 个循环，最后 72 延伸 10 min。扩增反应结束后取出放置于 4 。4.44.4.1 PCR 扩增产物的电泳检侧，称取 1.5 g 琼脂糖加入 100 mL 核酸电泳缓冲液中加热，充分溶化后稍放凉，加入适量的溴化乙锭 (终浓度 0.5 g/mL)，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取 510 L PCR 扩增产物分别
11、和 3L 上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。5V/cm 恒压下电泳 30 min 左右。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。5 结果判定5.1 试验结果成立条件试验结果成立条件，猪乙型脑炎病毒核酸阳性对照的PCR 产物，经电泳后在314 bp 位置出现特异性条带，同时阴性对照PCR 产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立（参见附录C）。5.2 阳性判在试验结果成立的前提下，如果样品的 PCR 产物电泳后在 314 bp 位置上出现特异性条带，判定为猪乙型脑炎病毒核酸阳性（参见附录 C）。5.3 阴性在试验结果成立的前提下，如果 3
12、14bp 位置未出现特异性条带，判定为猪乙型脑炎病毒阴性（参见附录 C）。5.4 可疑若在314 bp 位置上条带极弱，应做复核试验，再次出现 314 bp大小条带判定为猪乙型脑炎病毒核酸阳性，否则判定为阴性。DB41/T 151520174AA附录A（规范性附录）常规试剂的配制A.1 1核酸电泳缓冲液：Tris碱，24.2 g；冰乙酸，5.71 mL；0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)，10mL；加去离子水定容至 100 mL，使用时用去离子水作 50 倍稀释，即为 1核酸电泳缓冲液。A.2 0.01 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A液（0.2 mol/L
13、磷酸二氢钠水溶液） ：NaH2PO4H2O 27.6 g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1 000 mL。B液 （0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液 ）： Na2HPO47H2O 53.6 g，（或Na2HPO412H2O71.6g或Na2HPO42H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释并定容至1 000 mL。0.01 mol/L PBS的配制：A液14 mL，B液36 mL，加NaCl 8.5 g，最后用蒸馏水稀释并定容至1 000 mL；121，15 min高压灭菌，4保存备用。A.3 阳性对照样品：经灭活的猪乙脑病毒细胞培养毒。A.4 阴性对照样品：B
14、HK21 细胞培养液。A.5 DEPC水，用 0.1 %DEPC处理后的去离子水，经 121 15 min高压处理，用于溶解RNA。DB41/T 151520175BB附录B（规范性附录）猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 试验所用引物猪乙脑病毒RT-PCR试验所用引物见表B.1。表 B.1 猪乙脑病毒病毒 RT-PCR 试验所用引物引物名称 引物浓度 引物序列PCR扩增上游引物JEV-P120 pmol/L 5- ggatggtgcc tgcattgg -3PCR扩增下游引物JEV-P220 pmol/L5- ccgactccag acaatttttt tgt -3DB41/T 151520176CCDB41/T 151520177DD附录C（资料性附录）猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 扩增图猪乙型脑炎病毒RT-PCR扩增图见图 C.1。图C.1 猪乙型脑炎病毒RT-PCR扩增图注：注 P:猪乙型脑炎病毒阳性对照；N：阴性对照；M：DNA Marker DL 2000_
