1、ICS 65.020.01B16DB41河南省地方标 准DB41/T 14222017蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光 RT-PCR检测方法2017-07-07发布 2017-10-07实施河南省质量技术监督局发布DB41/T 14222017I前 言本标准参照SN/T 21552008给出的规则编写。本标准由河南省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：河南省农业科学院园艺研究所。本标准主要起草人：王利民、蒋卉、董晓宇、符真珠、张和臣、王慧娟、李艳敏。本标准参加起草人：高杰、张晶、袁欣。DB41/T 142220171蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了蝴蝶兰建兰花叶
2、病毒（Cymbidiummosaicvirus）实时荧光RT-PCR检测的术语和定义、方法原理、仪器、用具、试剂、引物和检测方法。本标准适用于蝴蝶兰植株建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改）适用于本文件。SN/T 21552008 建兰花叶病毒检测方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1建兰花叶病毒建兰花叶病毒（Cymbidium Mosaic Virus，CymMV），为马铃薯X病毒属（ Potexvirus）病毒，该病毒
3、的分类地位、粒体结构、理化性质、基因组结构、传播方式参见附录A和SN/T 21552008。4 方法原理建兰花叶病毒为ssRNA病毒，通过反转录酶和DNA聚合酶的作用将RNA反转录为cDNA，针对核酸保守序列设计引物，对cDNA进行PCR扩增，分析PCR检测结果，可明确材料中是否含有病毒的核酸成分。采用实时荧光RT-PCR方法，可实时监测每次扩增中特异性序列扩增的目的片段累积量，荧光信号随时间变化形成一条曲线。通常在10个15个循环的荧光值设定阈值和基线，荧光产生进入指数期、线性期和最终的平台期，依次可以在PCR反应处于指数期的某一点上来监测PCR产物的量。荧光强度首次超过设定阈值时PCR所需
4、的循环次数为 Ct值，与样本细胞中表达稳定、丰度较低的基因（内参基因，如 Actin、 GAPDH等）的 Ct值进行相对定量分析，检测目的RNA片段的相对含量。5 仪器、用具、试剂及引物5.1 仪器实时荧光PCR仪（本检测方法适用于ABI、Bio-Rad、Roche的实时荧光PCR仪）、高速冷冻离心机、漩涡震荡仪、核酸蛋白测定仪、-20 冰箱、-80 超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机等。5.2 用具DB41/T 142220172移液枪、移液枪头、离心管、PCR板、研钵等。5.3 试剂所用试剂参见附录B。5.4 引物蝴蝶兰建兰花叶病毒的实时荧光RT-PCR特异性引物为 Cymv-F：5-TGCC
5、AGACGGTGCTATCGTA-3、Cymv-R：5-AGAAAGGT GGAAGAGGTCGTTG-3，扩增获得目的片段大小为182 bp。蝴蝶兰实时荧光RT-PCR内参引物为 PeActin-F：5-CTCTTTCACAACCACTGCGG-3、 PeActin-R：5-TGGGCACCTAAATCTCTCAGC-3，扩增获得目的片段大小为181 bp。6 检测方法6.1 样品采集取蝴蝶兰的心叶叶尖部位5 g作为待检测样品，所取得样品及时进行检测或-60 以下低温保存。6.2 RNA 提取6.2.1 加入 1.5 mL Trizol至 2 mL 离心管中备用。6.2.2 取 1 g2 g
6、 样品液氮速冻研磨后加入离心管中，快速混匀，漩涡震荡2 min3 min。6.2.3 加入 300 L三氯甲烷，漩涡震荡混匀 2 min3 min，4 条件 12000 r/min 离心15 min。6.2.4 缓慢吸取 850 L上清到新 1.5 mL 离心管中，加入 850 L异丙醇，颠倒数次混匀，-20 静置2 h 左右。6.2.5 4 条件，12000 r/min离心 10 min；用枪头吸除上清，倒扣沥干余液 1 min左右。6.2.6 加入 70%酒精 1 mL，颠倒数次后，震荡仪 25 条件 750 r/min震荡 30 min。6.2.7 4 条件，750 r/min离心 1
7、min，用枪头吸除酒精；4 条件，750 r/min离心 1 min，用枪头吸除酒精，倒扣晾干1 min 左右。6.2.8 加入494LddH2O，轻弹离心管至DNA 完全溶解。6.2.9 加入 5 L DNase buffer （100） 和 1 L DNase混匀，37 温育 60 min，除去DNA。6.2.10 加入500 L P/C，混匀漩涡震荡 5 min；4 条件，12000 r/min离心 10 min。6.2.11 取上清液440 L至新 1.5 mL 离心管，加入 400 L 异丙醇和40 L NaAC溶液，颠倒混匀数分钟，-20 放置30 min左右。6.2.12 4 条
8、件，12000 r/min 离心10 min，用枪头吸除上清，倒扣在滤纸上 1 min左右。6.2.13 按 6.2.6 操作。6.2.14 按 6.2.7 操作。6.2.15 加入50 L ddH2O；完全溶解后，震荡仪25 条件，750 r/min震荡 30 min。6.2.16 -20 保存备用。6.3 RNA 浓度及纯度检测采用超微量分光光度计测定RNA 浓度和纯度。RNA浓度检测结果应150 ng/L，RNA溶液的A260/A280的比值范围为 1.82.1为宜, A260/A230 的比值范围为2.02.4为宜。-20 保存备用。6.4 反转录DB41/T 1422201736.4
9、.1 采用 cDNA合成试剂盒（可按商品试剂盒说明书操作）。取9 L RNA 至新的1 mL离心管中，加入1 L 的Oligo（dT）和 1 L dNTP，将试剂混合均匀。65 反应5 min，迅速转移至冰上骤冷。6.4.2 采用 cDNA合成试剂盒（可按商品试剂盒说明书操作）。将6.4.1 的反应产物中，加入4 LPrimeScriptIIBuffe（5）、3.5LRnase freeH2O、0.5 L Rnase Inhibitor、1 L PrimeScriptII Rtase，试剂按比例混合均匀后分装。42反应 60 min，72反应 5 min，完成反转录过程。-20 保存备用。6.
10、5 实时荧光 RT-PCR 反应6.5.1 实时荧光 RT-PCR 反应体系以蝴蝶兰建兰花叶病毒重组质粒为阳性对照，以ddH2O为空白阴性对照，以 PeActin引物组合为相对定量引物。Cymv引物的反应体系为：10 L SYBR Green Mix、0.8 L Cymv-F和0.8 L Cymv-R引物、2.4 L样品cDNA，补充ddH2O定容至20L，混匀分装至PCR管中，短暂离心备用。PeActin引物的反应体系为：10 L SYBR Green Mix、0.8 L PeActin-F、0.8 L PeActin-R引物、2.4 L样品cDNA，补充ddH2O定容至20L，混匀后分装至
11、PCR管中，短暂离心备用。6.5.2 实时荧光 RT-PCR 反应程序将制备好的样品置于实时荧光PCR仪上，设置95 预变性1 min；95 变性10 s，60 退火延伸30 s，39个循环（Cycle）；绘制溶解曲线设置65 5 s，95 0.5 c（Cycle）。仪器操作方法按仪器使用说明书执行。6.5.3 实时荧光 RT-PCR 检测结果分析查看溶解曲线（图1）。溶解曲线为单峰时表明特异性扩增，溶解曲线为多峰时表明反应不成功，建议重新进行步骤6.5的操作。查看扩增曲线（图2）。扩增曲线包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期，为一条平滑的S型曲线。查看实时荧光RT-PCR检测相
12、应的结果文件。查看 Cymv和 PeActin 引物分别检测的样品时的 Ct值；图 1 实时荧光 RT-PCR 溶解曲线DB41/T 142220174图 2 实时荧光 RT-PCR 扩增曲线6.6 结果判定6.6.1 待测样品内参基因 PeActin引物 Ct值为18 Ct20， Cymv引物 Ct值为40时，判定结果为阴性。6.6.2 待测样品内参基因 PeActin引物 Ct值为18 Ct20， Cymv引物 Ct值为35时，则判定结果为阳性。6.6.3 待测样品内参基因 PeActin引物 Ct值为18 Ct20， Cymv引物 Ct值为35 Ct40时，应重新进行测试。如果测试的 C
13、ymv引物 Ct值为40时，则判定结果为阴性；如果重新测试的 Cymv引物 Ct值为35 Ct40时，则判定结果为阳性。6.7 样品的保存与试验记录所有样品保存于-60 超低温冰箱，瓶苗保存于组培室中，盆栽苗保存于温室中以备复核。完整的试验记录：样品的来源、种类、取材时间、实验的时间、地点、方法和结果、样品保存位置、试验结果样品保存位置等，并要有经手人和实验人员的签字。实时荧光RT-PCR检测应有相应的结果文件。DB41/T 142220175AA附录A（资料性附录）建兰花叶病毒A.1 学名建兰花叶病毒 Cymbidium mosaic virus（CymMV）。A.2 分类地位CymMV属线
14、形病毒科（ Aphaflexiviridae）马铃薯X病毒属（ Potexvirus），ssRNA病毒。A.3 粒体结构病毒颗粒呈线状，长度475 nm，宽度13 nm，螺旋对称，螺纹明显，螺距为2.8 nm。CymMV粒体为核糖蛋白体，有一种结构蛋白（外壳蛋白）和基因组ssRNA组成。外壳蛋白的分子量为23.6 kDa左右，有220个氨基酸组成。核酸为线性正义链ssRNA，分子量为2.5106，大小约为6.3 kb。A.4 理化性质CymMV的紫外线最高吸收峰为266 nm，最低峰246 nm，沉降系数为113S，吸光度260/2 80=1.11.13，稀释限点510-5，钝化温度65 70
15、 。通过一次PEG沉淀，在蔗糖密度梯度离心后病毒成明显的条带。室温下粒体保毒期为7 d30 d，汁液在有机溶剂中较稳定。A.5 基因组结构CymMV的RNA基因组全长为6227 bp，3末端有poly（A）加尾，5端有带帽结构，与马铃薯X病毒属类似。其基因组结构包括5个开放式阅读框（ORF），ORF1编码一个大小为160 kDa的依赖RNA聚合酶，ORF2ORF 4编码一个分子量为26 kDa/13 kDa /10 kDa的三基因连锁结构，ORF5编码24 kDa的外壳蛋白。CymMV所编码的蛋白与马铃薯X病毒属其它成员编码的对应蛋白有很高的同源性。不同地理来源的CymMV基因序列亲缘关系很近
16、，核酸序列的相似性达91 %99 %，编码的蛋白基因核酸序列相似性达97.8 %。A.6 传播方式该病毒通过汁液、桃芽等刺吸式类害虫传播。DB41/T 142220176BB附录B（资料性附录）蝴蝶兰建兰花叶病毒实时 RT-PCR 荧光检测试剂B.1 RNA提取试剂B.1.1 75%酒精（DEPC ddH2O配制）取75 mL无水酒精，加入25 mL DEPC ddH2O，混匀备用。B.1.2 三氯甲烷/水饱和酚（P/C）200 mL 三氯甲烷，加入200 mL水饱和酚混匀静置，4 保存。B.2 RNA凝胶检测试剂B.2.1 0.5 mmol/L EDTA18.61 g Na2EDTA2H2O,加入80 mL的ddH2O，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约2 g NaOH） ，加入ddH2O定容至100 mL，高温高压灭菌，室温保存。B.2.2 50TAE242 g Tris碱，52.1 mL冰乙酸，100 mL 0.5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，加蒸馏水至1 L，使用时加入蒸馏水稀释至1TAE。_
