1、ICS 65.150 B 50 备案号 :54157-2017 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 375 2017 代替 DB11/T 375-2006 水生动物检疫名录及病原检测方法 List of aquatic animal diseases and its detection method 2017 - 03 - 22发布 2017 - 07 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 3752017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准替代 DB11/T 375 2006水生动物检疫名录及病原检测方法，与 DB11/T 3752
2、006 相比， 除编辑性修改外主要技术变化如下： 修改了标准适用范围 (见 1)； 修改了检疫名录 (见 3,2006年版的 3)； 修改了病原检测方法（见 4.2,2006年版的 4）； 删除了资料性附录 A、 B、C 、 D、E 、 F、 G、 H、I 、 J（见 2006年版的附录 A、B 、 C、D 、 E、 F、 G、 H、I 、 J）； 删除了结果报告单（见 2006年版的 5）； 增加了采样、抽样规格、抽样水温的规定 (见 4.1)； 增加了资料性附录 A“鲫造血器官坏死病诊断规程” （见附录 A）。 请注意文件 的某些内容可能涉及 专利 ，本 文件 的发布机构不承担识别这些专利
3、 的 责任 。 本标准 由北京市农业局提 出并归口 。 本标准 由北京市农业局组织实施 。 本标准起草单 位： 北京市 水产技术 推广站 。 本标准主要起草 人： 曹欢 、王姝 、王小亮 、王静波 、曹洁 、徐立蒲 、那立海 、贾丽 、张文、王澎。 本标准 所代替标准的 历次 版本发布情况为: DB11/T 3752006。 DB11/T 3752017 1 水生动物检疫名录及病原检测方法 1 范围 本标准给出了水生动物检疫名录及病原检测的方法。 本标准适用 于水生动物检疫 以 及相 关疫病的 监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于 本文件 的应 用是必不可少 的。 凡是 注日期的 引用 文
4、件 ， 仅所 注日期的版本适用 于 本 文 件。凡是不 注日期 的引 用文件， 其最新 版本（ 包括所有的修改单）适用 于本 文件。 GB/T 15805.1 鱼类 检疫方法 第1部分 ：传染 性胰脏 坏死病 毒(IPNV) GB/T 15805.2 鱼类 检疫方法 第2部分 ：传染 性造血器官坏死病 毒(IHNV) GB/T 15805.4 鱼类 检疫方法 第4部分 ：斑点叉尾鮰 病 毒(CCV) GB/T 15805.5 鱼类 检疫方法 第5部分 ：鲤春 病毒 血症病 毒(SVCV) SC/T 7103 水生动物 产地 检疫采样技术规范 SC/T 7212.1 鲤疱疹 病毒 检测方法 第1
5、 部分 ：锦鲤疱疹 病毒 SN/T 2503 淡 水鱼 中寄 生虫检疫技术规范 SN/T 3584 草 鱼出血病检疫技术规范 3 检疫名录 检疫对 象及 其相 应的检疫范围见 表1 。 表1 检疫名录 序号 检 疫 对 象 检 疫 范 围 1 鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp ， SVC） 鲤 鱼 、 锦鲤、金鱼等鲤科鱼类 2 草 鱼 出血病（Hemorrhage disease of grass carp， GCRV） 青 鱼 、草鱼 3 传染性造血器官坏死病（Infectious haematopoietic necrosis ,IHN） 虹鳟等冷水性鲑科鱼类
6、4 锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease ， KHVD） 鲤 、 锦鲤 5 鲫造血器官坏死病（Goldfish haematopoietic necrosis ,GFHN ） 金鱼、鲫 6 传染性胰脏坏死病（Infectious pancreatic necrosis ,IPN） 虹鳟等冷水性鲑科鱼类 7 斑点叉尾鮰病毒病（channel catfish virus disease ,CCVD） 斑点叉尾鮰 8 小 瓜虫病（Ichthyophthiriasis ） 淡 水 鱼类 4 病原检测 4.1 采样方法 DB11/T 3752017 2 采样按照 SC/T 71
7、03的规定执行，抽样规格及抽样水温见表 2。 表2 抽样规格及抽样水温 序号 检 疫 对 象 抽 样 规 格 抽 样 水 温 1 鲤春病毒血症 苗种或成鱼 1020 2 草 鱼 出血病 苗种或成鱼 2030 3 传染性造血器官坏死病 6月龄以下苗种 815 4 锦鲤疱疹病毒病 苗种或成鱼 2030 5 鲫造血器官坏死病 苗种或成鱼 1526 6 传染性胰脏坏死病 3月龄以下苗种 1014 7 斑点叉尾鮰病毒病 苗种或成鱼 2530 8 小 瓜虫病 苗种或成鱼 1525 4.2 检测方法 病原检测方法见 表3 。 表3 检测方法 序号 检 疫 对 象 检 测 方 法 1 鲤春病毒血症 GB/T
8、15805.5 2 草 鱼 出血病 SN/T 3584 3 传染性造血器官坏死病 GB/T 15805.2 4 锦鲤疱疹病毒病 SC/T 7212.1 5 鲫造血器官坏死病 见附录 A 6 传染性胰脏坏死病 GB/T 15805.1 7 斑点叉尾鮰病毒病 GB/T 15805.4 8 小 瓜虫病 SN/T 2503 DB11/T 3752017 3 A A 附 录 A （资料性附录） 鲫造血器官坏死病诊断规程 A.1 病原 鲫造血器官坏死病 毒（ Goldfish haematopoietic necrosis virus， GFHNV）。 A.2 样品要求 A.2.1 水温 采集样 品时 的
9、水温 应在 1526 。 A.2.2 品种 采样品种 为金 鱼、鲫及 其杂交种 。优先 采集金 鱼， 其次为 鲫鱼 ，及 其它杂交品种。 A.2.3 数量 按照SC/T 7103 执行 。 A.2.4 状态 已死亡 鱼样 不采 集。 A.2.5 信息采集 需 采 集金 鱼、鲫及 其杂交种 发 病情况 、混养 其它 鱼类发病 情况 、采样水温 等信息。 A.3 临床症状及流行病学特征 A.3.1 临床症状 患金鱼 造血器官坏死病的 金鱼、鲫， 特别是 杂交种 ，具有 下列 临床症状 ： 最显著 的特征 为鳃 部严重充 血 , 濒死病 鱼鳃 部开始大量出血，血 液不 断的 顺着鳃丝流到体外； 体表
10、、下 颌等处 分布 大量点状出血 点； 病 鱼 没有 生气 ， 不吃食， 在水面缓游，病 情 严重时由于严重贫 血使得 鳃明 显退色， 皮肤和 鳃 上 有白色 斑块 ，症状 和锦鲤 发生的 锦鲤疱疹 病毒 病不 同； 将病鱼 解剖后 可见 其肝 发白 ， 脾和肾肿 大， 脾上 有白色结 节。 A.3.2 流行病学特征 患金鱼 造血器官坏死病的 金鱼、鲫， 特别是 杂交种 ，具有 下列 流行 病学 特征 ： GFHNV具有 较高 的传染 性， 但 它的 感染 谱较 小， 仅感 染金 鱼、鲫， 特别是 杂交种； 该病流行 的水温适 宜范围 为 1526 ， 即当池塘 水温 自然上升至 15时 ，疾
11、病 开始 发生， 而 继续上升至 26以上时 ， 这种疾病 发生率会 大 幅度下 降 ； 而当秋季 温度开始下 降 ， 特别是降DB11/T 3752017 4 低 到 26以 下时 会再 次流行 ； 该病严重时 死亡 率较高 (可以 达 90%以 上) ；被感 染的鱼可以 长期 带毒 。 A.4 实验室检测 A.4.1 试剂和材料 A.4.1.1 水：符合 GB/T 6682中一级水的规格。 A.4.1.2 GFHNV阳性样 品： 符合国家有关规定。 A.4.1.3 Taq酶 ：20 保存 ，不能反复冻融 或温 度剧烈 变化。 A.4.1.4 dNTP： 含dCTP、 dGTP、dATP 、
12、 dTTP各 10 mmoL/L。 A.4.1.5 MgCl2：25 mmoL/L。 A.4.1.6 引物： 浓度 为100 pmoL/ L。其序 列如下： CyHV-pol-F：5 -CCCAGCAACATGTGCGACGG-3； CyHV-pol-R：5 -CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。 扩增 CyHV 1-3型 pol基因 362 bp片段 。 A.4.1.7 引物： 浓度 为100 pmoL/ L。其 序列 如下： GFHVN-F： 5 -CTACACGCCTCGCATCAT-3； GFHVN-R： 5 -CTCCACGGTCCTCATCTT-3。 扩增 GFHNV D
13、NA helicase基因 451 bp片段 。 A.4.2 器材和设备 A.4.2.1 普通冰箱和超低 温冰箱 。 A.4.2.2 组织研磨 器。 A.4.2.3 离心机 和离心管 。 A.4.2.4 PCR扩 增仪 。 A.4.2.5 水平电泳仪 。 A.4.2.6 微量移 液器及 吸头 。 A.4.2.7 紫外观察灯 或凝胶 成像 仪。 A.4.3 样品处理 A.4.3.1 取肾、 脾、 鳃和 脑组织 ，成 熟雌 鱼还 需取卵巢 液。 A.4.3.2 将所取 样品 匀浆 成糊 状，按 1： 10的最 终稀释 度悬 于 磷酸盐 缓冲 液或 M199细胞培 养液 。 A.4.4 DNA抽提
14、A.4.4.1 CTAB+酚/氯仿 /异戊醇 抽提法 将 450L 悬液放入1.5mL 的 离心管 ，再 加入 450L CTAB 溶 液 并 混 匀 ， 25 作 用2小 时。在 含有 样 品的离心管 中加 入600 L抽 提 液 ，用 力 混 合 。 12000r/min离心5min ， 取 上 层 水相（ 约 800 L）。再 加 入 700L 抽 提 液 ，用力混 合。 12000r/min离心5min ， 取 上 层 水相（ 约 600 L）。再加 入预 冷的 1.5倍 体积的 无水 乙醇 （ 约900 L ），倒置数 次混 匀后， 放置 离心管 于 20下， 至少 8h后 取出。
15、12000r/min 离心30min ， 倒去 上清 液。 将离心管 倒置 于吸 水纸 上， 吸干 液体。加 11L DEPC 水 溶解后 ， 作为PCR 模 板 。 DB11/T 3752017 5 A.4.4.2 DNAzol抽提 法 将100L 悬液放入1.5ml 的 离心管，再加入1ml DNAzol ，颠倒混匀5次，室温下 静 置 5min， 10600g （11400r/min ） 离心10min ； 吸取上 清约 1ml，加 入 0.5ml无 水 乙醇 ， 颠倒 混匀5 次， 室温下 静置 5min， 18000g （15000r/min ） 离心30min ； 吸弃 上清，加入
16、 500L 75% 的 乙醇清洗 ， 18000g（15000r/min ） 离心 5min； 吸弃乙醇 ，干燥 5min；加入 50L DEPC 水（ 60预热 ），60 保 温5min ； 即 为提取 的 DNA， 作 为 PCR 模板。 A.4.4.3 DNA提 取试剂盒 抽提 法 具体参 照试剂盒说 明书 。 A.4.5 DNA扩 增 A.4.5.1 扩增CyHV pol 基因反 应 体系 为 100L： 在0.2mL反 应 管中加 入10 L模板 、 2.5 L dNTP、 10 L 氯 化镁溶 液 、10L 10 倍 Taq酶缓 冲液、 CyHV-pol-R和CyHV-pol-F各
17、 1L 、 2.5U Taq酶 、加 DEPC水 至 100 L。将反 应管 置于 PCR扩增 仪。反 应程 序：94 变性5min； 94 变性1min 、 60 退火1min、 72 延伸1min， 40次 循环 ；72 延伸 10min； 4 保温。 A.4.5.2 扩 增GFHNV DNA helicase 基因 的 反应 体系 为100 L ：在 0.2mL反应 管 中加 入10 L模板 、2.5 L dNTP、 10L氯 化镁溶液 、 10L 10 倍Taq 酶缓 冲 液、GFHNV-R 和GFHNV-F各 1L、2.5U Taq 酶 、加 D EPC水 至100 L 。将反 应管
18、置 于 PCR扩增 仪。 反应 程序： 94 变性 5min；94 变性 1min、55 退 火1min、 72延伸 1min， 40次 循环 ；72 延伸 10min； 4 保温。 A.4.6 设 立对照 A.4.6.1 在6.3 样品处 理过 程中 应设立 阳 性样 品对 照、 阴性样 品对照、 空白 对照。 A.4.6.2 取GFHNV 阳性样 品抽 提核酸作 为 阳性 对照。 A.4.6.3 取正常 的鱼组织 抽提 核酸作 为 阴性 对照。 A.4.6.4 取等体 积的水代替 模板作 为空白 对照。 A.4.7 琼脂糖电泳 用TBE 电泳 缓冲 液， 配制 1.5%的琼脂糖 平板 （
19、含1 L/mL EB）。 将平 板放入 水平电泳 槽， 使电泳 缓冲 液 刚好淹 没胶 面。 将6 L样 品和2 L上 样缓 冲液 ，按比例 混匀 后加 入样 品孔 。在电泳 时使 用核酸 分子 量 标准参 考物 作对 照。 5V/cm电泳约 0.5h,当溴 酚蓝 到达底 部 时停止 。 在 紫外 观察灯 下 或用 凝胶 成像 仪观察 扩增带 并判 断结果。 A.4.8 测 序 取 362bp DNA片段 PCR产物 进行基因 序列 测定， 将测 序结果与 GenBank中参 考序列 进 行同 源性比 对。 A.4.9 结果判定 A.4.9.1 PCR后阳 性对 照 会出 现一 条 362 b
20、p的DNA 片段（ 当用 CyHV pol基因 引物 时 ）或 者451 bp 的DNA 片段（ 当用 GFHNV DNA helicase基因 引物 时）， 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 没 有 该扩 增带。 A.4.9.2 如果被 检测样 品有 典型 的临床症状 ， 同 时其 中任 何一 个 PCR检测结果 为阳 性，则 可 判 定 为 金 鱼 造血器官坏死病。 A.4.9.3 如果被 检测样 品无 临床症状 ， 当 二个 PCR检测结果 均为 阳 性，则 可 判 定 为 GFHNV感染 。如果 仅G FHNV的 helicase基因 PCR检测结果 为阳 性，则 判为 GFHNV可 疑； 否则， 判定 为GFHNV阴 性。 _
