1、ICS 65.150 B 50 备案号 :38199-2013 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 987 2013 鲟鱼种质鉴定规范 Rules of sturgeon germplasm identification 2013 - 06 - 21发布 2013 - 10 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 9872013 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 学名与分类 . 1 4 生物学特征 . 1 5 生长与繁殖 . 2 6 遗传学特征 . 3 7 检测方法 . 5 8 检测规则 . 7 参考文献 8 DB11/T 987
2、2013 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产科学研究所。 本标准主要起草人：胡红霞、朱华、董颖、田照辉、王巍。 DB11/T 9872013 1 鲟鱼种质鉴定规范 1 范围 本标准适用于西伯利亚鲟（ Acipenser baerii）种质 的检测 和鉴定 。 本标准给出 了西伯利亚鲟的学名与分类、主要生物学特征、生长与繁殖、遗传学特征 及检测方法。 2 规范性引用文件 下列文件 对于本文件的 应用 是必不可少 的。 凡是注日期的引用
3、文件 ，仅 所 注日期的 版本适用于本文 件。凡是不注日期 的引用文件，其最新版 本（ 包括 所有的 修改 单） 适用于本文件。 GB 17716 青鱼 GB/T 18654.2 养殖 鱼类种质检 验 第2部 分 抽样 方法 3 学名与分类 3.1 学名 西伯利亚鲟（ Acipenser baerii） 3.2 分类地位 属 鲟 形目 （Acipenseriformes）, 鲟科（Acipenseridae）, 鲟属 (Acipenser)。 4 生物学特征 4.1 外部形态 鱼体修 长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻 长 尖， 口腹 位， 口裂较小，一字形。 歪 形尾，鳃盖骨愈合
4、为一, 鳃盖膜彼此不相连而 与颊部相连。 体裸露无鳞具五列骨板，1 列背骨板， 2两列 侧骨板， 2列腹骨板；第一背骨板不是最大 的骨板 ,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通 常与 躯干 部颜 色 相 似；腹骨板 与背骨板 间具有 许多星状薄 骨板或微 小 颗粒 ，吻 须4根 ，介 于 吻突与口 裂 之间 ，稍靠近 口 裂 。鳃 耙有 结节 ，一 般为 3个。 鱼体背部呈 淡灰黑色或暗褐色，两侧较 淡，腹部为 白色。 西伯利亚鲟的 外部形 态见图 1。 DB11/T 9872013 2 图 1 西伯利亚鲟外部形态图（引自 FAO） 4.2 可数性状 背 鳍鳍式 ：D.30 56 。 臀鳍鳍式
5、：A.17 33 。 背骨板 数： 10 20。 侧骨板 数： 37 56，通 常为 42 47。 腹骨板 数： 716 。 第一鳃 弓（ 左） 外侧鳃 耙数 ： 2049 ，通 常为 27 32。 4.3 可量性状比例 西伯利亚鲟 鱼种 、成 鱼和 亲鱼的 可量 性状比例见表 1。 表1 西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值标准差） 项 目 年龄 鱼种（8 月龄） 成鱼（3 龄） 亲鱼（10 龄 ） 全 长 /体 长 a1.31 0.04 1.25 0.06 1.28 0.04 体 长 /体高 6.65 0.64 6.15 0.04 5.53 0.51 体 长 /头 长 3.69 0.25 3.
6、79 0.34 4.09 0.28 头 长 /吻 长 1.74 0.17 2.09 0.18 2.09 0.17 头 长 /眼径 22.13 1.97 23.52 6.72 23.70 4.21 头 长 /眼间距 3.59 0.48 3.17 0.39 3.29 0.30 头 长 /尾 柄 高 8.47 1.23 6.39 1.51 5.75 1.01 尾 柄 长 /尾 柄 高 2.84 0.64 2.28 0.57 2.5 0.52 a 采 用 从 吻 端到尾鳍基部的长 度 5 生长与繁殖 5.1 生长 DB11/T 9872013 3 在 人 工 养 殖 条 件 下 ,不 同年龄 组的西伯
7、利亚鲟 鱼体 长和体重 范围 见表 2。 表2 西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围 年龄 a1 2 3 4 5 体 长 cm 40 50 50 70 70 85 90 100 100 120 体 重 g 400 600 1500 2000 3000 4000 5000 7000 7000 9000 a 依据北方地区流水养殖模式 ，年龄以周年计 5.2 繁殖 性成熟年龄 ： 自然条 件下雌 鱼为 19龄 20龄 ， 雄 鱼为 17龄 18龄 ； 人 工养 殖 条件下 雌鱼为 7龄以上 ， 雄 鱼为 5龄以上 。繁殖 周期： 野 生状态 下为 2年以上 ； 人工养 殖条 件下为 1年以上。 怀卵量占
8、 体重 的10% 30%。 6 遗传学特征 6.1 细胞遗传学特征 采用流式 细胞仪 测定 西伯利亚鲟 鱼细 胞中 DNA含量 为 N=8.980.115 pg。 6.2 生化遗传学特征 西伯利亚鲟 肝脏酯酶 （EST） 同工 酶有 6条 酶带 ，电泳图 及 酶带电泳 模式图见图 2。 1为电泳 图谱 ， 2为 模式图 图2 西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及 模式 图 6.3 分子遗传学标 记 6.3.1 西伯利亚鲟特 异性 RAPD遗传图谱的 建立 及特征标 记 RAPD引物（ CCGCCCAAAC） PCR扩增 的结 果如 图3 所示 。 DB11/T 9872013 4 图 3 RAPD引物
9、的 扩增产 物 1为西伯利亚鲟 池， 2、3 为 西伯利亚鲟 个体， 4为 marker 6.3.2 西伯利亚鲟 微卫星 DNA分 子标记 的建立 采 用 14对微卫 星引物 进行 基因型 鉴定， 西伯利亚鲟 在这14 对引物的 等位 基 因长 度 范围 见表 3。 基 因 型数据 分析 结果 见图 4。 表3 14 个微卫星 引物 序列 及其在 西伯利亚鲟的 等位 基因 长度范围 位 点 名 称 引物序列 (5 -3 ) 等 位 基 因 长 度 范围 (bp) Atr-1101 F:TATCCCCTCCACTGGAAAT R: GTTAAACATCCCTGCCTTCA 143 203 Atr
10、-105 F:CGATTTGATTGGCTCTTGTA R: TGCAAATAAATTGGAGCTGA 157 173 Atr-107 F:GGCAGGATTACATCTCCTGA R: TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT 188 242 Atr-109 F:ACCCGAGCTGTCACATTACT R: AAAATAACGCGAATTCCTGA 162 300 Atr-114 F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTT R: TGCATTCAGAGAATAACCGA 201 251 Atr-117 F:TGCATGACACAGGACTTACC R: TGCCTCTC
11、AATAGCAACATC 191 259 Abr 39 F:ACCCGCAATTATTAGGAC R: CAGGACAAACTCAGACCC 178 276 Abr 40 F:TCACGCAGTCTCACAAGG R: TTCAATGGCAAACAGCAC 384 418 Abr 41 F:ACACTATCCCGCCACAAT R: CCACTGAAGCCATCATCT 322 410 Afu19 F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTAC R: CAGGTCCCTAATACAATGGC 120 139 Afu22 F:TCCACAATCCTGAATAATGAC R: GCACCATCTA
12、ATACGAAATTG 140 242 Afu39 F:TTCTGAAGTTCACACATTG R: ATGGAGCATATTGGAAGG 119 140 Afu54 F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAG R: CAAAGGACTTGAAACTAGG 149 221 Afu68 F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC R: AGCCCAACACAGACAATATC 128 250 DB11/T 9872013 5 图4 微卫星 标记基因型 数据 分析结果 图 7 检测方 法 7.1 繁殖力检测 按照 GB 17716的生物测 定方法。 7.2 细胞遗传学特征 测定 7.2
13、.1 采 鲟 鱼尾 动脉血 0.5ml， 加入肝素 处理过 的 1.5mL小指管 中， 低速 （1000rpm） 离心 3 min， 弃 上清。用 0.8%的生 理盐 水洗涤三次后 ，在 管 中 加满 70%的冷乙醇固 定过夜 ，注 意固 定 时使 细胞 充分 散开。 7.2.2 取 细 胞悬液浓 度调整 到 10 6 cell/ml样品 1ml，用 RNA酶 10 g/ml 20 g/ml 37水 浴消 化 0.5h； 碘化 丙碇 50g/ml 4染 色 30min。 7.2.3 将 处 理过 的样 品用 细绢布过滤后 ，加入 适量 的同 样处 理 的鸡血 红细 胞， 上流式 细 胞仪 测定
14、 荧光 强 度 ，计 算西伯利亚鲟 鱼与 鸡血 细胞 （N=2.8pg ）荧光强度之比 ，即 可得 到鲟 鱼的 DNA含量 。 7.3 生化遗传学特征 测定 7.3.1 试验材料 西伯利亚鲟 30尾 以上 。 7.3.2 样品制 备 剪断鱼 的尾动脉 ，放血。 随后解剖 ， 迅速摘取肝组织 0.5g左右 ，置于0 生 理盐 水 中， 用生 理盐 水 洗去组织 血污 。然 后称重 ，放入 玻璃匀浆器 中，按 1:5（g/ml）的 比例 加入0.1M pH7.0 的 冰冷 磷酸缓冲 液中进行 冰浴 匀浆 。 匀浆 后在4 冰箱 放置 1小时 ， 4 条 件下， 12000rpm离心 30min，
15、吸取 上清液 ， 分 装 于 0.5ml离心管 中，-80低 温冰箱 中保存 ，供 同工 酶电泳 分析 用。 7.3.3 电泳分 析 7.3.3.1 电泳分 离条 件： 电泳 缓冲 液 0.2M tris-Gly pH8.3，分离 胶 为 10%，浓 缩胶 为 4%，小 型双垂 直 电泳 槽电泳电 压 100V， 电泳时 间 为 9h10h ，之 后改为 电 压 60V，电泳时 间为 6h 7h。 7.3.3.2 加样及 电泳 ： 每槽 加样 7 l， 与等 体积 的溴酚蓝蔗糖 液混匀 后加 样，在 4 冰箱 中进行电泳。 7.3.3.3 染色： 将 -萘酚 0.1g和 -萘酚 0.1g溶 解
16、 于 10ml丙 酮 中，加 0.2M磷酸缓冲液 至 100ml， 加固 蓝 0.1g配成 染色 液。凝胶板在 37与 染色 液，保温 30min50min ，即 可呈 现棕 红色同工 酶区 带， 用蒸馏 水冲 洗 3次后 ，7% 醋酸固 定。 7.4 分子遗传学标 记方 法 表 示 西伯利亚鲟 品种 池 表示非 西伯利亚鲟 样品 DB11/T 9872013 6 7.4.1 试验材料 从 西伯利亚鲟 群体 中分 别随 机 抽取 同龄 鱼30尾 以上， 进行尾 椎静 脉采 血， ACD抗凝 ， 去 除血 浆后 -20 保存。 或剪取 西伯利亚鲟 鳍条约 0.5g，置 于75% 酒精中常温保存
17、。 7.4.2 基因 组 DNA的制 备 利用常规 苯酚/氯仿 法抽提 个体基因 组DNA ，利用紫 外 分光光度 法确定DNA 浓 度，将 个 体 基因 组 DNA 液 稀释至 浓度 10ng/l； 从每个个 体基 因组的 DNA稀释 液 中取 出10 l集 于一 管 中，制 成品 种的 池DNA 。 7.4.3 PCR扩增反应 扩增反 应总 体积 为25 l，其 中 包括 摸板 DNA30 ng、 10PCR 缓冲 液 （含 Mg 2+ ） 2.5l、 dNTPS（ 2.5mM each） 2l 、Taq 酶（ 5u/l）0.3 l、引物1pM（ RAPD法 和微 卫星DNA法分 别使 用
18、 各自 的引物 ）。 RAPD法 反应 程序 为： 95 预变性 5min， 94 45s、 36 45s、 72 90s， 45cycles,72延伸5min 。 微卫星DNA法 反应程 序为 ： 94变 性45s 、退火 45s（ 各引物 退火温 度详 见表4 ） 、72 延伸45s ， 40 cycles,72再 延伸5min 。 扩增反 应结 束后 ， 取 5l 产物与 1l 上样 缓冲 液混 合点样，在 含 溴 化 乙 锭 的 1.4%琼脂糖凝胶 中电泳 1h2h ，电 压80v ，紫 外灯下 观察 结果 并拍 照记录 。 表 4 14个微卫星 位点 重复序列结构和 退火温度 位点名
19、称 重复序列结构 退火温度 ( ) Atr-1101 (TATC)10 55 Atr-105 (GATA)15 50 Atr-107 (TAGA)17 57 Atr-109 (GA)5(TAGA)20 55 Atr-114 (TAGA)23 60 Atr-117 (GATA)8 55 Abr 39 (TATC)18 58 Abr 40 (TCTA)6(TAGA)12 61 Abr 41 (TCTA)17 65 Afu19 (TTG)5 53 Afu22 (TAAA)5(GAA)19 52 Afu39 (CAA)14 55 Afu54 (GATA)2(GACA)2 55 Afu68 (GATA)
20、21 55 7.4.4 结果分 析 7.4.4.1 RAPD法结果 分析 向 PCR产物 中加入 上样 缓冲液 ， 94解 链5min， 迅速置 于 冰中 冷却至室温 ，4 保存备 用。 使用95% 酒精把 长板 擦洗 一 遍， 待 酒精 挥发 后涂 1.5mL亲 和 溶液 ； 再 使用 95%酒精把 短 板也 擦洗 一遍 ， 待 酒精 挥发 后涂 200 L剥离 溶液 。 取 6%变 性聚 丙烯酰胺 溶 液80mL ， 加入 60 L四甲 基 乙二胺 ， 180 L的 10% 过硫酸 铵 （ 现用 现配 ）， 充 分 混匀 后灌 入两 块玻璃 之间 。用 鲨 鱼 齿梳子 的背 面沿 两 玻璃
21、 板缝隙 水平插入DB11/T 9872013 7 胶 中 约 5mm6mm 。 等 约1.5h 待 凝胶 聚合 后， 拔出 梳子， 用 自来 水将 玻璃 板表 面冲 洗 干净 ， 擦 干后 装在 电 泳 槽 上。 向电泳 槽的 上下 缓冲 液 槽中 加入 0.5 TBE缓冲 液 ， 使 缓冲 液没 过短 板。 1800V恒压预 电泳 20min。 预电泳 之后 ，在 每个 加样 孔中加入 5 L解 链后 样品 ，1800V 恒压 电泳1.5h 2.5h。 电泳结 束后，小 心 分 离 两 块 玻璃 板， 将 粘有 凝胶 的长 板 浸入染 色液 中， 染 色5 min 15min， 用蒸馏 水
22、漂洗 30s，浸 入在 显影 液 中显影 至带型清 晰， 再用 蒸馏水 漂洗 5min。晾 干长 板后， 拍照 纪录 结果 。 7.4.4.2 微卫星 DNA法结果 分析 使 用 普通 微卫 星引物 进行 PCR扩增时 ，基 因型 判读 同上 述 RAPD法。 使 用 荧光 微卫 星引物 进行 PCR扩增时 ，直 接使 用基 因分 析 仪进行 基因型 判读 。 使 用 软件 STRUCTURE 2.3对 基因型 数据 进行 综合 分析 。 8 检测规 则 8.1 检测分类 检测分 为鉴定 检测 和质 量一 致 性检测。 8.2 检测项 目 鉴定检测 项目包括 外部形 态特征、 可量 性状 、
23、可 数性状 。 质量 一致 性检测 项目包括细胞 遗传学特征、 生化遗传学特征、分 子遗传学特征。 8.3 取样 样品鱼 的抽样 按GB/T 18654.2规 定执 行。 8.3.1 组 批 以同龄 期的西伯利亚鲟 为同 一 批。 8.4 判定规定 各 项 检测 指标 在标准范围 内则判 定为 西伯利亚鲟。 DB11/T 9872013 8 参 考 文 献 1 Ludwig A. Identification of Acipenseriformes species in trade J.Journal of Applied Ichthyology, 2008, 24: 2-19. 2 陈 细华
24、 . 鲟 形目鱼 类生物学与 资源 现状 M.北京：海洋 出版 社,2007:附 录 4. 3 CITES. Identification Guide-Sturgeons and Paddlefish. Minister of Supply and Services, Canada. 2001. 4 孟庆闻 ,苏锦 详 ,缪 学祖 . 鱼 类分类学 M.北京： 中 国农业出 版社 ,1995. 5 Billard R, Guillaume L. Biology and conservation of sturgeon and paddlefishJ. Reviews in Fish Biolo
25、gy and Fisheries, 2001, 10: 355-392. 6 Gisbert E, Ruban G I. Ontogenetic behavior of Siberian sturgeon, Acipenser baerii: A synthesis between laboratory tests and field dataJ. Environmental Biology of Fishes, 2003, 67: 311-319. 7 Holcik J. The freshwater fishes of Europe. V1: PartII. General introdu
26、ction to fishes Acipenseriforms. AULA-Verlag Wiesbaden, 1989. 8 Ruban G I. The Siberian sturgeon, Acipenser Baerii Baerii, population Status in the Ob RiverJ. The Sturgeon Quarterly, 1996, 4(1/2): 8-9. 9 Ruban G I. Species structure,contemporary distribution and status of Siberian sturgeon, Acipense
27、r baerii. Sturgeon Biodiversity and ConservationM. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1997: 221-230. 10Vasilev V P, Sokolov L I, Serebryakova E V. Karyotype of the Siberian sturgeon Acipenser baerii Brandt from the Lena River and some questions of the acipenserid karyotypic evolutionJ. Vopr Ichthyol, 1980, 23: 814-822. _
