1、B05DB河北省地方标准DB13IT434一2000甘薯脱毒种苗培育及生产规程2000一04一29发布创叮北省质分效术生怪局2000一05一01实施发布DB13/T434一2000前官本标准由河北省农林科学院提出。本标准由河北省农林科学院昌黎果树研究所、秦皇岛市甘蒋研究开发中心起草。本标准主要起草人:章德明、韩继成、郭恩才、陈久铁、杨军。河北省地方标准DB13/T434一2000甘薯脱毒种苗培育及生产规程1范围本标准规定了脱毒甘薯核心原种、原原种、原种等三级萦殖材料(其形态包含种薯、薯秧，以下简称种苗)培育及生产技术、工作程序的要求。本标准适用于甘薯核心原种、原原种、原种脱毒种苗的培育和生产。
2、2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB7413一87甘薯种苗产地检疫规程。3定义本标准采用下列定义3.1核心原种指经过检侧确认，无本规程确定的应脱除病毒的试管苗，在网室隔离条件下外移及系统的种性鉴定后形成的优系种薯。3.2原原种由核心原种，在网室隔离条件下(包括苗床及落地)形成的种苗。3.3原种由原原种，在空间隔离条件下(包括苗床及礴地)形成的种苗。3.4网室隔离以40目以上尼龙网建成的带有1.5m进深级冲间的网拥。3.5空间隔离以育苗床、田间采蔓圃及种
3、薯田的外缘为界，向外垂直距离5JDOm范围内，无普通甘薯田、蚜传寄主及黄花植物。4应脱除的病毒甘薯羽状斑驳病毒Sweetpotato feathery Mottle Vuv$(SPFMV)甘薯潜隐病毒Sweetpotato Latent Virus(SPLV)5核心原种翻犷北省质骨李几浏卜生门卜月.2000一04一29批准2000一05一01 aftDB13/T434一20005.1脱毒5.气少外植体选定在临近田间收获前，取拟脱毒品种健壮单株的蔓尖，材料应具该品种的典型性状(包括地上部及块根)。5.1.2外掉林灭菌用75%酒精浸搅90S，取出后，再用0.1%升汞(城C12)灭菌7min，随即用
4、无菌水冲洗3次以上，放在垫有滤纸的培养皿中，在加皿盖保鲜条件下，将外植体附着的水分吸去。5.1.3剥够尖在解剖镜下切取0 . 2mm一0.3mm大小的茎尖(不多于2个叶原基)，迅速置于5.1.4温度:24C 1 1C;光照时间:12h一14h;光强:冷光灯2500Lx;培养基:ms，附加成份根据不同品种初代茎尖分化生长的需要，确定BA等生长调节物质相应5.1.5;pH5.4一5.80当试管苗长到4一5片展开叶时，将其移至38七11的条件下热处理20d05.1.6切取小“I经热处理后的试管苗，再切取一次小茎尖(0. 5mm左右)进行培养，培养条件同5.1.405.1.7建立单株左声)茎尖发育，获
5、得单株后，编号。5.2检测5.2.1 NCM一ELISA初检淘汰当单株(系)的试管苗展开叶达6片以上时进行。按株(系)取样，保留每株的顶芽和带1个基部芽的原株继代。中部材料用NCM一ELISA初检，淘汰呈阳性反应的单株(系)。通过初检的单株(系)继续扩繁。检测方法见一2一DB13/T434一20附录A(标准的附录)。5.2.2指示植物检侧确认通过NCM - ELISA的阴性株(系)继续扩萦，在单株(系)有10株以上时，外移7株一8株。待恢复生长、每株形成10片叶以上时，同巴西牵牛嫁接。每单系接5株，以3株成活用子观察有效。检侧方法见附录A(标准的附录)。5.3试管苗生产5.3.1组培快策将最终
6、确认已脱除病毒的保留株(系)进行组培快繁。采用侧芽增殖路线，以避免出现愈伤组织及由其形成的不定芽，即每次继代均切取带1一2个芽的茎段，在试管内徽扦插。培养条件同5.1.405.3.2试管萦殖的时期控制5.3.2.1冀东地区:用于春栽时(5月上旬)，应于3月1日后进行试管内锻炼(在自然光、温条件下进行，外移前2d-3d逐渐打开瓶盖)，为期1周，4月1日前移栽于有隔离网的温室。经扦插扩萦后，于5月上旬栽植于落地网室。用于夏栽时(7月中旬)，应不晚于5月1日进行试管内锻炼，6月1日前移栽于隔离温(网)室。经扩繁后，于7月中旬栽植于礴地网室。5.3.2.2冀中南地区:以冀东地区为准，春、夏栽分别提前、
7、错后10d一15d05.3.2.3河北以外地区:可根据当地生产物候期，具体拟定。5.3.3试管苗外移及管理用营养钵(高10cm，直径6crn)单株移栽，用硫松肥沃的营养土(园土:蛙石:腐熟有机肥=6:3:1)。外移操作严防植株机械损伤。外移之初，拥内温度不低于15t，白天不高于28r,，空气相对湿度不低于75%。同时注意防病、防治地下害虫。级苗成活，发出新根后，控温降湿。当植株长至10csn、有5片展开的健壮叶片时，放风艘炼。一般经7d一10d即可剪蔓并按株系分行、段栽人落地网室继续进行扩繁。5.4露地网室栽植及管理DB13/T434一20005.4.1礴地网室的选址尽地隔离网室应建在向阳、无
8、遮挡、有水源、排水好、近周无蚜虫寄主和黄花植物的地方，土质以沙城土为宜。5.4.2土集准备，对选作礴地网室的地块进行平整，并深翻20cm一30cm，每亩施有机肥2000掩一300掩，甘薯专用肥50吨。应控制氮肥施用量，防止徒长。5.4.35:4.4网室建立后，按栽植行距起垅备用。网室的准备及建立尽地网室以南北向为宜，跨度8m一lom，高度3m一3.2m，长度按栽植A而定。可采用镀锌管材料或其它(竹木、水泥等)用材的拥架结构。搭建后，选用40目以上的尼龙纱网进行扭盖封闭。5.4.5栽植时间移栽于璐地网室的时期见5.3.205.4.6栽植密度5.4.6.1春季的采芡圃:株行距按20cm x 30c
9、rn栽植。5.4.6.2夏薯密度:株行距按25cm x 60an05.4.6.3边垅、垅端，与网基保持0an的距离。5.4.7栽植方法按当地常规方法。5.4.8田间管理5.4.8.1灌排控制。早浇涝排，不早不浇，保持土坡持水量在70%左右。5.4.8.2及时除草网室内于薯秧封垅前除草2一3次;网室外距网2m内不得生长杂草，斋及时除净。5.4.8.3采蔓圃的蔓秧长至15.一20crn时摘心，促发侧蔓，增加采蔓量。夏落不摘心。5.4.8.4自栽植到收获期间，每周喷1次防刺吸式口器昆虫.的农药，同时网面喷布相应的驱进药荆。5.4.8.5网室内薯芡不可接触纱网，应随时将其弓!向网室内部。一4一DB13
10、1T434一20005.4+8.6夏薯生长中后期提蔓2次，防止徒长。5.5收获5.5.1为提高种薯质量，收获期可稍迟于露地种薯，以网室内地面气温不低于15时为准。5.5.2收获时，剔除伤、病、畸形薯。5.5.3按品种株系分袋包装，每袋内、外分别系好标签，防止混杂。5.6贮藏5.6.1核心原种应专窖贮藏，并于收获当日人窖。5.6.2种薯人窖后，利用自然低温，降低窖温至12士it。并依次于人冬前及解冻后，及时封、开通风口，防止窖温剧烈变化。5.6.3定期检查窖温，及时调节，防止烂薯。5.7品种及其生产性能鉴定对经验侧已确认脱毒的株(系)，通过继代培养、锻炼后，移人核心原种网室进行栽培观察认定。在团
11、棵期及秋季收获时，进行品种种性鉴定并测定淀粉含童(淀粉型品种)及其单位面积产量，从中选出符合其品种特征特性的最优株系，.以用于原原种的扩繁。6原原种6.1繁育原原种的基本条件及种薯的一般标准6.1.1用于繁育原原种种苗(薯)的繁殖材料，必须是省级指定的专责单位繁育的核心原种。6.1.2原原种的生产必须在隔离网室内进行。6.1.3网室生产的种薯，必须符合本品种的典型性状，单薯重A以100g一200g为宜。6.2原原种育秧及苗床。6.2.1加温火炕、电热温床及利用太阳能的冷床均可繁育种秧。6.2.2苗床设置在隔离网室内，防虫措施见5.4.8.2,5.4.8.406.2.3育苗时采用稀排薯，改拔秧为
12、剪秧。一5一幻舰别如34一%Tii,.i6.3网室的栽植、管理、收获及贮藏。同核心原种。见5.4,5.5,5.606.4去劣。在团裸、封垅前、收获前，按垅顺序调查，拔除可疑带毒株及变异株。7.种7:1策育原种的基本条件7.1.1用于萦育原种的挤殖材料，必须是经省(或市)级主管部门批准的原原种偏育单位的原原种苗。7.1.2原种生产的空间而离用于生产原种的苗床、采艳一、种落田，采用空间隔离防止虫传，以育苗床、圈、田块周围的外缘为界，向外垂直距离又拍m的范围内无普通慈、蚜虫寄主植物及黄花植物。7.2.传毒昆虫的防治当地蚜虫发生季节，每周喷1次防蚜农药，其它季节每两周喷药1次。7.3去除带毒显症株及杂
13、株原种生产全程，按下列时期进行田间调查，去除带毒显症株及非原品种的杂株。a)苗床期:出秧、育秧中期、每次采芡时;b)生长期:团裸、封垅前、剪芡前、生长中期、收获前。7.4原原种及原种的育秧及田间管理，除上述要求外，其它与常规生产管理相同。8脱弃种苗生产的程序8.1种苗产地的条件8.1.1种苗一地的选择按GB7413一87中的4.1执行。8.1.2凡准备生产原原种、原种的单位和农户必须分别向所在地的市、县植检部门申报并坟写“甘薯脱毒种苗生产申报表”，见表10一6一DB13/T434一2000表1甘，脱毒种苗生产申报表申报单位(农户)联系人繁殖地点面积品种种著级别隔离条件种苗来源主管机构审批惫见备
14、注注:申报表1式3份，1份交植检部门、1份交送检验部门、1份留申报单位(农户)备查。8.1.3甘薯脱毒试管苗、核心原种的生产，由省级指定的甘薯脱毒种苗繁育专责单位或由其委托的省级单位负责。8.1.4原原种的生产，由有生产条件的、并得到省级指定的甘薯脱毒种苗检测专责单位或由其委托的市级植检部门认可的单位(或农户)进行。8.1.5原种的生产，由有生产条件的、并经所在县的植检部门认可的单位(或农户)进行。8.1.6原种以下级别的种薯(即生产种)由农户自行繁育，繁育条件参照原种生产。8.2脱毒种苗的育繁8.2.1核心原种的试管苗每两年更新一次。8.2.2原原种生产单位所用的种苗必须由省级指定的甘薯脱毒
15、种苗萦育专责单位提供，如由国家级(徐州甘薯研究中心视同国家级)以外单位引人，须经省级指定的甘薯脱毒检侧专责单位的认可。其生产程序由市级检疫部门按本规程进行监督。一7一DB13/T434一20008.2.3原种生产单位所用种苗必须是原原种种苗，其生产程序由所在地(市、县)检疫部门按本规程进行监督。8.3种苗地防疫措施8.3.1病毒病以外的病虫害防疫按GB7413一87中的4.3执行。8.3.2脱毒种苗生产地的生产环境依种苗不同级别执行相应的防疫措施。84窖藏管理不同级次的脱毒种薯应分别收获、分窖储藏，其管理按GB7413一87中的5.4执行。9病毒检测9.1报检的种苗不带有GB7413一87所规
16、定的检疫对象和控制病害。9.2核心原种的检侧由省甘薯脱毒种苗检测专责单位进行，培育单位提出检侧的同时，须提供该品种的详细资料，包括品种名、生产性能等。病毒检侧必须同时用血清学检测和指示植物检测，并分别重复检测两次。检侧方法见附录A(标准的附录)。9.3原原种的检测由省级指定的甘薯脱毒种苗检测专责单位进行。9.4原种的检测由市级专责单位进行。9.5脱毒甘薯各级种苗生产单位(农户)报检时需填写“送检样本检侧申报表”，见表20表2送检样本检测申报多送检单位送检人送检时间年月日标本编号种落级别种薯面积种薯产地备住注:核心原种按系号，原原种按网拥号，原种按田块地号。申报表1式2份，1份交送检侧部门、1份
17、留申报单位(农户)备查。一8一DB13/T434一20009.6“不同级次种苗的检测标准”，见表30表3不同级次种苗的检测及标准种苗级次检测方法取样方法检样数t重复次数判断依据标准(带毒株率)备注核心原种指示植物嫁接法各脱毒试管单系并编号5株1单系2嫁接后2周左右，指示植物叶片有明脉、坏死、皱缩、褪绿等症状0有显症株者，全系汰除。原原种硝酸纤维膜一酶联免疫吸附法NCM一ELISA以网室为单位均匀取样按株编号，每5株为1组200组1000株1亩2以经指示植物检侧确认脱毒的植株为阴性对照指示植物嫁接法NCM一EL ISA检侧，呈阳性的组按该组单株分别取样5段茎段(1芽1段)2同核心原种0如有显症株
18、，降为相应允许带毒株率的级次。原种NCM一ELISA依隔离区自然形状，在米字线上按单株取样，每10株为1组100组1001株1100亩2同原原种NCM一ELISA经前步检侧呈阳性组，按该组单株分别取样阳性组:10株1组2不超过596(含596)阳性株超过标准时，降为生产种。一9一DB13/T434.一%l;“ 09.7出证:由承检单位签发“脱毒甘蒋种苗检侧报告”，见表衰4脱.甘，种苗检月报告送位单位送检日期年月日品种枪侧报告单编号位洲结果血清学位侧指示植物位侧符合种苗级别位洲单位(盆章)植侧人(签字)注:检侧报告1式3份，1份交植位部门、1份留位侧部门、1份留申报单位(农户)备查。一10一DB
19、13/T434一%100附录A甘薯病毒检洲方法(标准的附录)Al硝吸奸谁介膜一醉联免咬(NCM一ELISA，检翻甘，病弃方法Al. l级冲液的配制:Al.1.1 TBS pH7.5(以r.II计):Tris 4.84gNaa 58.料g用i 90ml燕馏水溶解并用浓HCl(浓度3796)调pH7.5。用燕馏水定容至2000m1,Al. 1.2样品提取级冲液(以100ml计):Nat以再0.2g用Im溶解并定容至100mloAl. 1.3抗体缓冲液(以100m1计):脱脂奶粉2g用TBS溶解并定容至100mloAl. 1.4洗涤级冲液T一TZ(以1000I计):1以犯ml飞16中加人0.5m1
20、Triton X一100或Tween一20,Al. 1.5底物级冲液(以100ml计):用9l燕馏水溶解1. 21g Tris, 0. 58g Naa, 0. 1g MgC1Z.6H20后，用浓HG(浓度3796)调声值至9.5，用燕馏水定容至100MIoAl. 1.6 NUT，母液闻盯，二甲基亚砚(70%)40mg1.2ml完全溶解后避光4保存。Al. 1. 7 BCIP母液BCI P20mgDB13/T434一2000二甲基亚砚(7096) 1.2m1.完全溶解后避光4保存。Al.2样品的制备:拟.2.1将待检侧样品每一序号植株的上部、中部、下部叶片各采集1片，分别收集在同1个塑料袋中并标
21、记样品序号(必须在实验当天完成)。.一检侧田间样品时，如果可能最好选择表现症状的或较老的叶片。A1.2.2从每一序号植株的3片叶片上各取1个直径lcm的回片。可将叶片it于塑料袋的上部并用小试管在塑料袋外部加压，取下回叶片，其余部分丢弃，往塑料袋内加人3m1样品提取级冲液研磨回叶片，可用试管或回木充分研磨植物组织。室温下静!塑料袋一3min一45min，直至植物汁液诊出，Al .3点样:处理硝酸纤维素膜时必须带手套并使用银子。指印会造成假阳性反应。硝酸纤维素膜使用前用直尺和铅笔在上面划上小方格，大小为9mm x9mm,A1.3.1将1张干操的毽纸放于实验台上，将硝酸纤维素膜放于其上。A1.3.
22、2用1个灭菌的干净吸管小心地吸取1滴样品袋中的上清液，摘在膜上方格的正中(上样时吸管尖端不能接触膜)。每个样品换1个干净吸管。Al.3.3重复步骤Al. 1.3.2，直至加样全部完成。从.3.4将膜转到1张干操的滤纸上，干操15min一30minoAl.4显色:所有的孵育和冲洗步魏均在室温下完成。也可放于合适的摇床，解育时绷率用50r，冲洗时用100r.Al A .1.加.30m1封闭液(们BS 0+ 2 6脱脂奶粉+296 Triton X一100或Tween一20)于培养皿中，将硝酸纤维紊膜以45度角浸人其中，进免产生气泡。室温牌育60mino此时，取0.1m1微量离心管中的病毒抗血清，在
23、烧杯中与30n-1抗体绷冲液混匀.准备好第一抗体溶液(每1病毒都如此准备)。12一DB13/T434一2000Al.4.2弃去封闭液并用TBS迅速漂洗，然后加第一抗体溶液于培养皿中，加盖并用封口膜或胶带密封以防燕发，室温孵育过夜。A1.4.3弃去第一抗体溶液，在30m1 T一TBS中，通过恒速振荡洗去未被结合的抗体，共洗4次，每次3mino同时用30m1抗体缓冲液仃BS+ 2%脱脂奶粉)稀释0. lml微量离心管中的酶标抗体，准备好酶标抗体溶液。A1.4.4弃去T一TBS，加人酶标抗体溶液，孵育lhoA1.4.5弃去酶标抗体溶液，如A1.4.3所述用30m1 T一TBS洗膜，共洗4次，每次3m
24、in，将未结合的酶标抗体洗去。在最后1次洗涤时制备NBT/BCIP底物溶液(显色反应溶液)。分别用干净吸管各取0.075m1 NBI，和BCIP母液加到25m1底物缓冲液中(先加人NBT然后加BCIP)。剩余的NBT、和BCIP母液放回4下避光保存。注意:溶剂剧毒并能被皮肤吸收，制备NBT/BCIP底物溶液时应戴手套。A1.4.6弃去最后1次的洗涤液，加人显色反应溶液。室温反应5min一30min。阳性反应表现出不同程度的紫色。如果在这段时间内没有可观察到的反应，反应便不会再发生，背景反应开始出现。A1.4.7弃去显色反应溶液终止反应，将膜在蒸馏水中洗3次，每次10minoA1.4.8将膜置于
25、滤纸上干燥，保存时用2张干滤纸夹住。A2指示植物检测甘挤病毒方法A2.1材料准备A2.1.1将待检测的脱毒处理过的甘薯试管苗盆栽于防虫措施良好的温室中，每1株系外移7株一8株，成活株数保证达6株以上。.A2.1.2外移的试管苗生长1个月左右，具5片一6片叶时盆播指示植物巴西牵牛(Ipomom setosa )，花盆直径不小于10cm。每待检株系及阳性对照各需生长健壮的巴西牵牛5株。DB13仃434.2“A2.之稼接A2.2.1巴西牵牛生长1个月左右具，I片-5片真叶，此时外移的待脸甘鑫苗具10片一15片叶以上时开始稼接。A2.2.2稼接采用腹接法，以巴西牵牛作为砧木，以外移待检的甘慈苗为接拍。
26、A2.2.3嫁接用接鹅取自甘落苗的中下部茎段，每个接称带一个单称及叶片。每单系嫁接5株，并做好相应的标记。:以3株成活以上用于观察有效渝A2.2.4一每次检泌均盆设A阳性对照6株。其来源为同品种未脱毒处理的试管苗。与经脱毒处理的试管苗同时外移、相同管理。A2沈.5取接移用的甘薯外移苗留1一2个基部芽，继续生长，同时再播第2批巴西牵牛，以便1个月后进行第2.次盆复稼接检侧，.、A2.2.6一稼接后白天保持气沮25r, - 30C，夜间23一25C并保持。8046一卿%.的空气相对湿度，适当遗荫。嫁接成活后，给予充足光服。X12.3症状观察A2.3:Y在水肥充足的精细管理下，嫁接成活后2一3周阳性对照及脱毒未净的待检株(系)开始出现病毒症状同一株(系)有1株显症，即列为未脱毒株系，全系汰除。2次检侧均未显症的株(系)，可确认为已达到符合本规程所要求的应脱除病毒的种苗标准。A2.3.2指示植物对病毒的反映症状。SPFMV:叶片出现明脉、叶脉坏死、皱编和失绿斑块。SPLV:叶脉失绿。一14一
