1、B41省DB13方标准卜JJ河地DB13/T492-2004猪免疫技术规程2004-03-10发布2004-03-10实施河北省质量技术监督局发布DB 13/I492-2004吕本标准的附录A,附录B为规范性附录。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位:河北省畜牧兽医站.本标准主要起草人:郑文波、李凯伦、白玉坤、王玉清、路广计、李志民、陶茂晖、王振来、李DH 13/I492-2004猪免疫技术规程1范围本标准规定了猪主要传染病的免疫程序、免疫操作方法、免疫操作要求和免疫效果监测.本标准适用于河北省境内各类养猪场对生猪的免疫。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准.2. 1疫苗Vaccine由
2、特定细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、支原体等病原微生物以及寄生虫制成的，能刺激机体产生相应抗病能力的制品.2. 2免疫接种Vaccinating将疫苗注入动物体内(肌肉、皮下、粘膜)使动物对相应疫病产生特异性抵抗能力的方法。2. 3免疫抗体监测Antibody nanitoring动物进行免疫接种后.在一定时期内，通过血清学或其他方法，对动物的免疫接种效果进行定性或定量测量。3免应程序3. 1仔猪仔猪免疫按下列程序进行:a)达到15日龄时，注射猪喘气病灭活苗(弱毒苗):b)达到.日龄时，注射猪瘟弱毒细胞苗:c)达到加日龄时.注射仔猪副伤寒弱毒苗和猪喘气病灭活苗(弱毒苗):d)达到45日龄时，注
3、射口蹄疫灭活苗:e)达到60日龄时.注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗.3. 2后备母猪后备母猪按下列程序进行:a)配种前1.5个月.注射猪乙型脑炎弱毒苗;b)配种前1个月.注射猪细小病毒弱毒疫苗;c)达到7月龄时，注射口蹄疫灭活苗:d)达到5月龄至7月龄时，注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗.33后备公猪后备公猪按下列程序进行:a)达到5月龄至配种前半个月，注射猪细小病毒弱毒疫苗和猪乙型脑炎弱毒苗:b)达到5月龄至7月龄，注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗。34可繁母猪可繁母猪按下列程序进行:a)每年5月份和10月份，各注射一次猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗:DH13厅492-2004b)每年4月份和10月
4、份，各注射一次猪喘气病灭活苗(弱毒苗):c)每年5月份和10月份，各注射一次口蹄疫灭活苗;d)每年11月份或12月份。注射猪传染性胃肠炎疫苗。e)配种前1个月，注射猪乙型脑炎弱毒苗;0产前40天.注射猪伪狂犬病灭活苗;d)产前40天和15天，各注射一次仔猪大肠杆菌三价灭活苗(弱毒苗);幼产前30天和15大，红痢疫区可繁母猪各注射一次仔猪红痢疫苗。3.5种公猪种公猪可按下列程序进行:e)每年5月份和10月份，各注射一次猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗;b)每年4月份和10月份，各注射一次猪喘气病灭活苗(弱毒苗)和猪伪狂犬病灭活苗:c)每年5月份和10月份，各注射一次口蹄疫灭活苗:d)每年11月份或12
5、月份.注射猪传染性胃肠炎疫苗。3.6商品猪商品猪可按下列程序进行:a)达到15日龄时，注射猪喘气病灭活苗(弱毒苗);b)达到加日龄时.注射猪瘟弱毒细胞苗;c)达到30日龄时，注射猪喘气病灭活苗(弱毒苗):d)达到35日龄时，注射仔猪副伤寒弱毒苗:e)达到45日龄时。注射口蹄疫灭活苗;乃达到“T日龄时.注射猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗.4免疫操作方法4. 1保定对猪进行确实保定。4. 2选定注射部位颈部耳后2cm9cm处或臀部肌肉丰富部位.4. 3注射部位消毒先用消水将注射部位擦洗，把污物擦洗掉.再用5%的碘配和s%的酒精，对注射部位由内及外划圆消毒。4. 4疫苗的稀释对需要稀释的疫苗，先将疫苗的
6、瓶口用75%的酒精消毒。再按照使用说明书要求的配比用稀释液或生理盐水进行稀释。4.5免疫接种用消毒好的注射器(或连续注射器)将配备好的疫苗.按照疫苗使用说明书要求的剂量注入猪体适宜部位。5免疫操作要求5.1猪在健康的情况下才能免疫。5. 2在注射弱毒病毒疫苗时.不得使用抗病毒类药物;在注射弱毒菌苗时。不得使用抗菌素类药物。5.3免疫前，对免疫注射部位用消1k酒精和碘可进行消毒.5. 4同一批次的猪要同时进行免疫。DH 13/I492-20046免疫效果监测6.1监测时间免疫后15d30d进行.8. 2采样比例种公猪100%，母猪FYY!，仔猪5%，商品猪5%06. 3待检样品制备采血5毫升.分
7、离血清备检。6. 4检测方法B. 4. 1猪瘟正向间接血凝试验或单抗酶联免疫吸附试验(ELISA)。单抗ELISA试验方法按附录A的规定进行。6.4.2口蹄疫正向间接血凝试验，试验方法按附录B的规定进行。DH13/I492-2004附录A(规范性附录)猪瘟单克隆杭体ELISA试验方法A. 1方法提要本方法主要用于检测猪瘟免疫是否合格.是否为猪瘟强毒感染。以便制定正确的免疫程序，保障猪群免遭猪瘟强毒的感染。所用抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪监强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用.如果在猪瘟弱毒酶联板上光密度(OD)大于或等于0.2且在
8、强毒酶联板上光密度(OD)小于0.5.说明猪只经弱毒疫苗免疫效果好且无猪瘟强毒感染。A. 2试剂a)碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钾、T i:_钠(无水)、磷酸氢二钠(12HZ0 ),氯化钾、柠檬酸、邻苯二胺(分析纯):b)吐温-20, 98%浓硫酸、30%l氧水(分析纯)，蒸馏水(双蒸)，小牛血清.人.3设备和仪器a)酶标仪，492nm波光片:b)固相%孔平底聚苯乙烯专用板;c)恒温培养箱;d)震荡器;e)移液器:乃天平(感量O.OOIg);目1000mL容量瓶若干;h) 1.OmL, S.OmL, f O.OmL移液管若干;i) 100mL, 250mL磨门锥形瓶若千。A. 4步骤A.
9、 4. 1试液的配制A.4.1.1包被液称取碳酸钠1. 59g和碳酸氢钠2. 93g放入1000mL容i-瓶中。加蒸馏水完全溶解后定容。加入适量311氢氧化钠溶液调PH为9.6,.4.1.2洗涤液a)称取氛化钠8. 0,磷酸三氢钾0.2g,磷酸氢二钠(无水)2.13g,氯化钾0.2g放入1000mL容量瓶中，加蒸馏水完全溶解后定容，加入适量3M氢氧化钠溶液调PH为7.4,b)量取上述溶液1000m1.放入1000mL烧杯中，加入吐7f -20 0_SmL.搅扑均匀。A.4.1.3稀释液量取洗涤液100mL放入2Oml磨I锥形瓶中，加入小牛血清SmL，充分摇匀.A.4.1.4底物液a)称取柠檬酸
10、21. 0g放入1000mL齐量瓶中.加蒸馏水完全溶解后定容。即成0. 1 M柠橡酸溶液。DB13(149-2004b)称取磷酸氢二钠(12HZ0) 71.6g放入1000mL容量瓶中，加燕馏水完全溶解后定容，即成。.ul磷酸氢二钠溶液.c)量取0. 1M柠檬酸溶液24. 3mL和0. 2M磷酸氢二钠溶液25. 7mL放入1 OOmL磨口锥形瓶中，摇匀.d)取上述混合液20mL放入100mL磨口锥形瓶中，加入邻苯二胺20mg摇匀。临用前加30%双氧75LeA.4_1.5终止液量取500mL蒸馏水放入1000mL烧杯中，缓慢加入76mL浓硫酸，搅拌均匀。人.4. 2包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗
11、原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作i4:倍稀释，以100匹分别加入做好标记的酶联板孔中，置湿盒于4过夜.A. 4. 3去孔内液体.用洗涤液冲洗板3次，每次间隔3min-5 min，拍干。A. 4. 4用稀释液将待检血清作SI:倍稀释，每孔加100泌.同时，将猪瘟阳性、阴性血清以100倍稀释作对照，37培育1.Sh2h,A. 4. 5重复A. 4. 3,A. 4. 6用稀释液将兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释。每孔加入10即L.37培育1.5h“-theA. 4. 7重复A.4.3oA. 4. B征孔加入底物液100匹.室沮下观察显色反应(当阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性
12、孔作空白调零).A.4.9每孔加入终止液50匹，于酶标仪上测定490mn波长的光密度(OD)e.5判定标准在猪瘟弱毒酶联板上:a) OD0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性;b) OD0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性.在猪瘟张毒酶联板上:a) OD0.5.为猪瘟张毒抗体阳性;b) OD0.5，为猪瘟强毒抗体阴性.DH 13/I492-2004附录B(规范性附录)正向间接血凝试验方法B. 1方法提要本方法主要用于检测口蹄疫免疫效价，以便制定正确的免疫程序，保障猪群免遭口蹄疫强毒的感染.接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:128为免疫合格。B.2试剂稀释液、口蹄疫止向血凝抗原、口蹄疫阴性对照血消、口蹄疫对照阳
13、性血清。B. 3设备和仪器a) V型血凝板;b)移液器;c)微量震荡器;d)恒温培养箱。B. 4操作步密B. 4. 1加稀释液在血凝板上L排一6排的1孔9孔;第7排的1孔一4孔和第6孔;第8排的1孔12孔各加稀释液50 uloB.4.2稀释侍检血清取1号待检血消SOIL加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手姆指轻压弹簧1次-2次混匀(避免产生过多的气泡)，从该孔取出50匹移入第2孔，泪匀后取出5:匹移入第3孔直至第9孔混匀后取出SOIL丢弃.此时第1排!孔9孔待检血清的稀释度(稀释倍数)依次为:1:2 (1)1:4 (2) 1:8 (3) 1:16 (4) 1_32 (5) 1:64 (6)
14、 1:128 (7) 1:256 (B) 1:512 (9),取2号待检血清加入第2排，取3号待检血清加入第3排均按上述方法稀释，注意每取一份血清时，必须更换塑咀一个.8. 4. 3摇释阴性对照血清在血凝板上的第7排第!孔加阴性血清50匹，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50匹丢弃。此时阴性血清稀释倍数依次为1:z (1)1:4 (2) 1.8 C3) 1:16 (4)。第6孔为稀释液对照。B. 4. 4希释阳性对照血清在血凝板上的第8排第l孔加阳性血消SOpL。对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出SOIL丢弃。此时阳性血清稀释倍数依次为1:2 (1)1:4 (2) 1:8 (3) 1:16
15、 (4) 1:32 (5) 1:64 (6) 1:128 (7)1:256 (8) 1:512 (9),8. 4. 5加正向血凝抗原被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照各孔均各加正向血凝诊断液(充分摇匀，瓶底应无血球沉淀)25WLa8. 4. 8振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上振荡lmin2min如无振荡器，用手轻轻摇匀，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀。不出现血球沉淀为合格.盖上玻板。室温卜或37下静置1.5h-DH 13/T492-20042h判定结果。B.5判定标准移去玻板.将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集(血
16、球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)，或仅出现“十”凝集(血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮)。阳性对照血消孔1:2-1:256各孔应出现“+十十十十+”凝集为合格，(少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内)0在对照孔合格的前提下，再观察特检血清各孔.以呈现“什”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1孔5孔呈现“什计+洲”凝集，6-7孔呈现“什”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集.那么就可判定该份血消的抗体效价为1:1280接种口蹄痊疫苗的猪群免疫抗体效价达到I :128(即第7孔呈现“什”凝集)为免疫合格.注:“一”表示完全不凝集或0-10%血球凝集。“+”表示1U%“.25%血球凝集.non表示SU%血球凝集.a+什”表示7$%血球凝集。af”表示90%一10%血球凝集.
