1、 B 41 河北省地方标准DB13/T 8112006羊传染性胸膜肺炎防治技术规程 2006-11-11 发布 2006-11-20 实施DB13河北省质量技术监督局 发布DB13/T 8112006 I前 言 本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E 为规范性附录。 本标准由河北省畜牧兽医局提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：汪恩强、袁万哲、钟秀会、孙继国、史万玉、黄会岭、金东航、郝满良、李铁拴、徐丰勋、刘小宝。 DB13/T 8112006 1羊传染性胸膜肺炎防治技术规程 1 范围 本标准规定了羊传染性胸膜肺炎的诊断、预防和治疗。 本标准适用于养羊场（
2、户）和动物疾病防治单位对羊传染性胸膜肺炎的诊断和防治。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 16548 畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程 GB 16549 畜禽产地检疫规范 GB 16567 种畜禽调运检疫技术规范 NY/T 388 畜禽场环境质量标准 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY 5149 无公害食品 肉羊饲养兽医防疫准则 N
3、Y/T 5151 无公害食品 肉羊饲养管理准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 羊传染性胸膜肺炎 Infectious pleuropneumonia of sheep and goats 又称羊支原体肺炎，是由支原体所引起的一种高度接触性传染病。 4 诊断 4.1 病原 引起羊传染性胸膜肺炎的病原体为丝状支原体山羊亚种( Mycoplasma mycoides subsp.capri)和绵羊肺炎支原体( Mycoplasma ovipneumoniae)。丝状支原体山羊亚种为细小、多变性的微生物，革兰氏染色阴性，用姬姆萨法、瑞氏法染色着色良好；绵羊肺炎支原体也呈细小而多形性，但
4、在适宜培养基上生长的菌落很小，生长要求比丝状支原体山羊亚种苛刻。在琼脂浓度较低的培养基上生长时，可呈现一般支原体都具有的“降落伞”状菌落，但琼脂浓度较高时则无此表现。绵羊肺炎支原体与丝状支原体山羊亚种无交互免疫性。丝状支原体山羊亚种对理化因素的抵抗力很弱。 4.2 流行病学 4.2.1 易感动物 不同品种、年龄、性别均会感染。在自然条件下，丝状支原体山羊亚种只感染山羊，3 岁以下的山羊最易感染，而绵羊肺炎支原体则可感染山羊和绵羊。 4.2.2 流行特点 本病一年四季都可发生和流行，但在早春、秋末冬初最常见。常呈地方流行性，冬季流行期平均为 15 d，夏季可维持 60 d 以上。 4.2.3 传
5、播途径 本病接触传染性很强，发病后在羊群中传播迅速，20 d 左右可波及全群。病羊是主要的传染源，肺组织和胸腔渗出液中含有大量病原体，主要通过空气飞沫经呼吸道传染。 4.2.4 发病率和病死率 易感羊群发病率可达 80100，病死率达 40以上，体质弱者高达 90。 4.3 临床症状 4.3.1 潜伏期 潜伏期短者 56 d，长者 21 d28 d。 DB13/T 8112006 24.3.2 最急性型 最急性型可见如下临床症状： a) 发病急骤，体温高达 4142，精神极度萎顿，食欲废绝，呼吸急促而有痛苦呻吟； b) 数小时后出现肺炎症状，呼吸困难，咳嗽，流浆液带血鼻液，肺部叩诊呈浊音，听诊
6、肺泡呼吸音减弱、消失或呈捻发音； c) 病羊卧地不起，四肢伸直，呼吸极度困难，随着呼吸全身颤动； d) 黏膜高度充血，发绀； e) 病程一般不超过 4 d5 d，有的仅 12 h24 h，有的在没有任何征兆情况下突然倒地死亡； f) 病死羊鼻孔中流出带血泡沫或血水，耳、颈下、腹部皮肤大片紫绀。 4.3.3 急性型 急性型可见如下临床症状： a) 患羊体温升高，精神沉郁，采食量逐渐减少； b) 继之出现咳嗽，伴有浆液性鼻液，4 d5 d 后，咳嗽变干而痛苦，鼻液转为黏液-脓性并呈铁锈色，黏附于鼻孔和上唇，结成干涸的棕色痂垢； c) 眼睑肿胀，流泪，眼有黏液-脓性分泌物； d) 口半开张，流泡沫状
7、唾液； e) 头颈伸直，腰背拱起，腹肋紧缩，怀孕母羊大批发生流产； f) 有的发生臌胀和腹泻； g) 唇、乳房等部皮肤出现丘疹； h) 濒死前体温降至常温以下。 4.3.4 慢性型 患羊全身症状轻微，体温变化不明显，间歇性咳嗽和腹泻，鼻腔内流出黏液性鼻液，采食量减少，生长发育迟缓，身体衰弱，被毛粗乱无光, 部分患羊有轻度瘤胃臌气、慢性眼结膜炎等症状。病程长者，可持续数月之久。 4.4 病理变化 剖检可见如下病理变化： a) 肺呈紫红色，切面呈大理石样，充血水肿，并有针尖状出血点； b) 胸腔常有淡黄色液体，有时多至 500 ml2 000 ml。胸膜变厚而粗糙，胸膜和肺表面有网状或条状的黄白色
8、纤维素凝块； c) 心包积液、黏连，心肌松弛、变软； d) 急性病例还可见肝、肾、脾、胆囊肿胀。 4.5 病原学诊断 4.5.1 病料采集与保存 无菌采集肺脏、胸腔渗出液、肺门淋巴结、心血等。肺病料剪成 3 cm5 cm 方块，胸部淋巴结以整个淋巴结为好，胸腔渗出液用吸管吸入灭菌青霉素瓶内。肺和淋巴结保存在用茶色广口瓶盛装的灭菌 50甘油缓冲溶液中，胸腔渗出液不加任何保存液。病料冰冻保存。 4.5.2 显微镜检查 将病料直接涂片，瑞氏或姬姆萨氏染色，由镜下按视野观察，羊传染性胸膜肺炎病原为细小的多形性菌体，呈球状、杆状、丝状等。革兰氏染色阴性。 4.5.3 病原分离培养 取精氨酸支原体肉汤培养
9、基 4.1 g，加 100 ml 蒸馏水，加热溶解，分装，每支试管 8 ml，121高压灭菌 15 min，4保存，用前加入 20小牛血清及抑菌剂。取支原体半流体培养基 3.9 g，加 100 ml 蒸馏水，加热溶解，分装，每支试管 8 ml，121高压灭菌 15min。使用前应煮沸 10 min15 min，冷至 56左右，每支试管内加入 2 ml 灭活小牛血清，摇匀。分别取精氨酸支原体肉汤培养基和支原体半流体培养基各 4 支，每支培养基接种胸腔渗出液或病料乳化液 0.5 ml1.0 ml，于 361培养 21 d。设生理盐水培养基作对照。在接种后的第七天，从 4 支中取 2 支进行次代培养
10、，分别接种 2 支精氨酸支原体肉汤培养基和支原体半流体培养基，于 361培养 21d。若在支原体半流体培养基内见到“降落伞”样白色菌落；精氨酸支原体肉汤培养基由黄色变为粉红色，管底有颗粒沉淀，表明有羊传染性胸膜肺炎支原体。取精氨酸支原体肉汤培养物或支原体半流体培养基上的典型菌落涂片，瑞氏、姬姆萨和革兰氏染色镜检，结果同4.5.2。 DB13/T 8112006 34.5.4 动物回归试验 取精氨酸支原体肉汤培养物和生理盐水作 1:1 稀释，分别注射到健康羊、家兔气管内，羊多在 1d7d发病，表现与自然病例相同的症状和病理变化，而人工感染兔不发病。 4.6 血清学检测 4.6.1 微量间接血凝试
11、验 按附录 B 规定的方法执行。 4.6.2 生长抑制试验 按附录 C 规定的方法执行。 4.6.3 代谢抑制试验 按附录 D 规定的方法执行。 4.6.4 直接免疫荧光抗体试验 按附录 E 规定的方法执行。 5 预防 5.1 加强羊群饲养 加强饲养管理，增强羊群的抵抗力。饲料要求按照 NY 5150 的规定执行；饮水要求按照 NY 5027 的规定执行；饲养管理按照 NY/T 5151 的规定执行；环境控制应符合 NY/T 388 的规定。 5.2 严格羊群检疫 建立基础母羊群，自繁自养。品种调整或补充种源，应按照 GB 16549 和 GB 16567 的规定，加强检疫。 5.3 隔离、封
12、锁和消毒 发现疫情及时上报，对发病羊群按 NY 5149 的规定进行隔离、封锁，并做好消毒工作。消毒剂的使用应符合 NY 5148 的规定。对病死、剖检羊尸体应按 GB 16548 的规定，进行无害化处理。 5.4 免疫接种 根据病原体分离结果选用适当的疫苗，按 NY 5149 的规定进行免疫接种。 5.4.1 平时预防 接种 对健康羊群每年春季或秋季预防接种一次。山羊传染性胸膜肺炎氢氧化铝灭活疫苗，预防由丝状支原体山羊亚种引起的山羊传染性胸膜肺炎，6 月龄以下山羊颈侧皮下注射 3 ml，6 月龄以上山羊 5 ml，注射后14 d 产生免疫力，免疫期为 1 年。羊肺炎支原体氢氧化铝灭活疫苗，预
13、防绵羊、山羊由绵羊肺炎支原体引起的传染性胸膜肺炎，成年羊颈侧皮下注射 3 ml，半岁以下幼羊 2 ml，免疫期可达 1 年半以上。对身体瘦弱、体温升高或有慢性疾病的羊，不宜注射。对怀孕母羊、新生羔羊和从异地引进的羊应及时补注射。 5.4.2 紧急免疫接种 一旦发病，立即对未出现症状、体温低于 40的假定健康羊全部注射山羊传染性胸膜肺炎氢氧化铝菌苗或羊肺炎支原体氢氧化铝灭活疫苗，疫区内或疫区周围的羊也应进行疫苗注射。待发病羊和可疑羊病情稳定后，再紧急注射疫苗。 6 治疗 6.1 抗菌消炎 可采用下列药物进行治疗： a) 大环内脂类: 乳糖酸红霉素注射剂 3 mg/kg5 mg/kg 体重，静脉注
14、射，每天 2 次，连用 2 d3 d。泰乐菌素注射液 5 mg/kg13 mg/kg 体重，肌肉注射，每日 2 次，连用 5 d7 d。 b) 广谱抗菌药类: 长效土霉素注射液 10 mg/kg20 mg/kg 体重，肌肉注射，每天 1 次，连用 5d。土霉素片剂 10 mg/kg25 mg/kg 体重，内服，每日 1 次，连用 2 d3 d。 c) 喹诺酮类: 恩诺沙星注射液 2.5 mg/kg 体重，肌肉或静脉注射，每天 2 次，连用 5 d7 d。 d) 氟苯尼考：20 mg/kg 体重，肌肉注射，每天 1 次。 e) 新砷矾纳明(914)： 12 mg/kg 体重， 以无菌生理盐水或葡
15、萄糖生理盐水稀释为 5溶液 （现配现用），一次缓慢静脉注射，3 d5 d 后对逐渐康复羊再注射一次，剂量减半。注意防治砷中毒。 f) 卡那霉素、丁胺卡那霉素、林可霉素、先锋霉素、磺胺制剂，用法及用量应符合中华人民共和国兽药典的规定。 g) 支原体易产生耐药性，治疗时要注意药物交替使用和较长时间用药。 6.2 制止渗出 510氯化钙或葡萄糖酸钙注射液 50 ml100 ml 、维生素 C2 g4 g，静脉注射。 DB13/T 8112006 46.3 止咳平喘 氯化铵片 1 g5 g、氨茶碱片 0.2 g0.4 g 或复方甘草合剂 10 ml20 ml，内服。 6.4 对症治疗 a) 减轻炎症反
16、应和缓解中毒，可静脉或肌肉注射地塞米松，每次 4 mg 12 mg。 b) 增强心脏活动， 可静脉注射 10安钠咖 0.5 g2 g 或樟脑磺酸钠 0.2 g1 g， 每天 2 次， 连用 2 d。 c) 呼吸困难者，肌肉注射盐酸麻黄碱注射液 0.02 g0.05 g。 d) 体温升高者肌肉注射安乃近注射液 1 g2 g。 6.5 建立并保存治疗记录，并应在清群后继续保存 2 年。 DB13/T 8112006 5附录 A （规范性附录） 培养基 A.1 改良 Hartley 氏消化汤培养基（液体培养基） 胰蛋白胨 8 g，灭菌Hartley氏消化汤 600 ml，灭菌 0.5水解乳蛋白Han
17、k s液 1000 ml，0.4酚红20 ml，混匀，加青霉素至 200 IU/ml，用 3.5 NaHCO3调节pH 至 7.6，用单板式滤器过滤除菌后，加入无菌灭能的猪血清 400 ml，分装于 10 ml玻璃瓶中，放入 37普通温箱做杂菌检验，待无菌生长便可使用。 A.2 改良 Hartley 氏琼脂培养基（固体培养基） 改良 Hartley 氏消化汤培养基中加入琼脂，使其含量达 1.31.5，经 121kPa 高压灭菌 30 min即成。 A.3 增菌培养基 马丁肉汤加 20马血清和 3 g/100 ml 酵母浸膏。 A.4 选择性培养基 系增菌培养基内加 80:1 的 1醋酸铊和青霉
18、素 200 IU/ml；制作平板时加 1国产琼脂。 DB13/T 8112006 6附录 B (规范性附录) 微量间接血凝试验 B.1 方法提要 微量间接血凝试验可用于羊传染性胸膜肺炎的诊断和监测。其原理是利用结合在红细胞上的羊传染性胸膜肺炎抗原在与血清中的抗体反应后，出现肉眼可见的凝集现象，据此便可判断被检者血清中是否含有羊传染性胸膜肺炎抗体。 B.2 试剂 a) 羊传染性胸膜肺炎间接血凝试验抗原、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、迭氮钠（分析纯）； b) 羊传染性胸膜肺炎标准阳性血清、羊传染性胸膜肺炎标准阴性血清、健康兔血清、蒸馏水。 B.3 设备和仪器 a) 恒温培养箱； b) 离
19、心机； c) 微型振荡器； d) 分析天平； e) 移液器； f) 96 孔 V 型（90 度孔底）微量血凝反应板； g) 100 ml 磨口锥形瓶； h) 1 000 ml 容量瓶。 B.4 操作步骤 B.4.1 材料准备 B.4.1.1 稀释液 a) 取 NaCl4.25 g、Na2HPO419.34 g、KH2PO42.86 g、迭氮钠 1.00 g放入 1 000 ml 容量瓶中，加蒸馏水完全溶解后定容，过滤分装， 10磅15 min高压灭菌， 即成0.1迭氮钠的0.15 mol/l磷酸盐缓冲液 （PBS） 。 b) 取上述溶液 98 ml 和健康兔血清 2 ml 放入 100 ml
20、磨口锥形瓶中，混合，无菌分装，04保存备用。 B.4.1.2 被检血清 无菌采集待检羊血液并分离血清，检验前 56灭能 30 min。 B.4.2 正式试验 B.4.2.1 加稀释液 取一洁净 96 孔 V 型血凝板，每个样品为一组，每组 15 孔加入稀释液 30 l。 B.4.2.2 稀释血清 于第 1 孔加入待检血清 30 l，用移液器逐孔稀释至第 5 孔，弃 30 l，此时 15 孔待检血清的稀释度依次为：1:2（1），1:4(2)，1:8(3)，1:16(4)，1:32(5)。同法稀释阳性及阴性血清，阴性血清组稀释至第四孔，预留第五孔作为稀释液对照。 B.4.2.3 加间接血凝抗原 被
21、检血清各孔、阴性血清各孔、阳性血清各孔、稀释液对照各孔均加间接血凝抗原 30l。加完后，振荡混匀，室温静置 2 h，判定结果。 B.5 结果判定 B.5.1 判定标准 a) 红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔底者为+，即 100凝集； b) 红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐且稍向孔底集中者为+，即 75凝集； c) 红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块者为+，即 50凝集； DB13/T 8112006 7d) 红细胞于孔底形成圆团状，但边缘不够光滑，且四周稍有凝集块者为+，即 25凝集； e) 红细胞于孔底形成圆团状，且边缘光滑整齐者为-，即无凝集。 B.5.2 判定方法 在阳性对照、阴性对照血
22、清，稀释液对照为（-）的前提下，对被检血清进行判定。被检血清 1:8 稀释度，凝集值+以上判定为阳性，1:4 稀释度凝集价+判为可凝，1:4 以下者为阴性。 DB13/T 8112006 8附录 C (规范性附录) 生长抑制试验 C.1 材料 a) 液体培养基：配制方法见附录 A.1； b) 不同支原体阳性血清： Mccp、丝状支原体丝状亚种、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种以及绵羊肺支原体； c) 滤纸。 C.2 操作步骤 将鉴定菌株 24 h 培养液摇匀，取 0.25 ml 滴于平板上，用 L 型玻棒将其均匀涂抹于培养平板表面后，用分别浸取了 4 倍稀释的不同支原体阳性血清、直径 7
23、 mm 的定性滤纸片分别贴附于平板表面，每块平板贴 34 片，37培养 24 h48 h。观察并记录抑菌圈大小。每株待检菌株作 3 次，求平均值。 C.3 结果判定 抑菌圈直径 2 mm 或以上者判为阳性。 DB13/T 8112006 9附录 D (规范性附录) 代谢抑制试验 D.1 材料 a) 选择性培养基：配制方法见附录 A.4； b) 葡萄糖； c) 酚红； d) 标准阳性血清； e) 阴性血清。 D.2 步骤 将含葡萄糖和酚红指示剂， pH值为 7.6 的支原体选择性培养基分装为每支试管 1 ml，在第 1 管中加入阳性血清 1ml，充分混匀后取 1 ml移入第 2 管，照此类推至第
24、 8 管。再向每管中加入上述培养基 1 ml，充分摇匀，使管内阳性血清成对倍稀释序列 22、23、24、25、26、27、28、29，每管加入被鉴定菌株 48 h培养菌液 0.02 ml。各组设不加菌液和加有阴性血清的对照管各 1 支，37培养 3 d14 d，每天观察，待颜色出现明显变化时，记录颜色变化，并测各管pH 值。其操作见表D1 。 表 D.1 羊传染性胸膜肺炎代谢抑制试验操作方法 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 阳性血清稀释倍数 2223242526272829- - 培养基 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - 阳性血清 1 1 1 1 1 1 1 1 弃 1
25、 1 1 培养基 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 鉴定菌液 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 - 0.02D.3 结果判定 以 pH 值下降 0.5 单位以内的最高血清稀释倍数为抑制的判定依据。 DB13/T 8112006 10附录 E (规范性附录) 直接免疫荧光抗体试验 E.1 试剂 a) 磷酸缓冲液（ PBS）； b) 标准抗羊传染性胸膜肺炎的荧光抗体。 E.2 器材 a) 荧光显微镜； b) 载玻片； c) 盖玻片； d) 恒温箱。 E.3 步骤 E.3.1 样品制备 取长好单个菌落的琼脂平皿培养物，加入约 5 ml 的 PBS，置室温 0.5 h，吸弃 PBS，再用铲刀切取琼脂培养物，置于载玻片。 E.3.2 染色 将稀释至工作浓度的荧光抗体，滴加在待检标本面上，室温恒湿染色 30 min，取 PBS 轻洗琼脂表面数次，荧光显微镜观察。同法用荧光抗体滴加阳性及阴性标本面，染色观察。 E.4 判定标准 被检标本的细菌结构完整清晰，并在阳性、阴性对照均成立时判定。在菌体中见到特异黄绿色荧光者判为阳性；如果所有菌体中无特异性荧光者判为阴性。
