1、ICS 65.020.30B 42DB13河 北 省 地 方 标准DB13/T 1100-2009出口肉鸡药物残留控制技术规程2009-06-17发布2009-07-02实施河北省质; in技术III.督局 发布DB13/T 1100-2009NO吕本标准附录A、附录B、附录C、附录D、附录E为规范性附录。本标准由河北省畜牧兽医局提出。本标准起草单位:秦皇岛市畜牧局。本标准主要起草人:李鹤飞、杨爱文、刘俊华。DB 13/T 1100-2009出口肉鸡药物残留控制技术规程1范围本标准规定了肉鸡出口企业允许使用的兽药、禁止使用的兽药、兽药供应企业资质审核、兽药违禁药品检验、兽药的供应和使用、饲料的
2、供应和使用、采样和鸡肉中违禁药物的检验等程序应遵守的准则。本标准适用于肉鸡出口企业对药物残留的控制。2规范性引用文件下列文件通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 20764-2006可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱紫外检测法NY 5029无公害食品 猪肉NY 5032无公害食品 畜禽饲料和饲料添加剂使用准则NY/T 5344.6无公害食品 产品抽样规
3、范第6部分:畜禽产品SN/T 1604-2005进出口动物源性食品中氯霉素残留量的检验方法酶联免疫法DB35/T 585-2004 鳗骊中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留检测方法一高效液相色谱一荧光检测法(不知是否为现行)吠喃哇酮代谢物(AOZ)快速检测试剂盒式说明书(农业部866号公告)3允许使用的兽药出口肉鸡允许使用下列兽药，也可根据进口国的要求适当增减:a)阿莫西林;b)林可霉素;c)大观霉素;d)庆大霉素;e)卡钠霉素;f)新霉素;g)粘杆菌素;h)安普霉素;i)青霉素;j)红霉素;k)替米考星;1)马杜霉素;m)中药制剂;n)生物制剂;o)多种维生素;DB13/T 1100
4、-2009P)微生态制剂。4禁止使用的药品出口肉鸡禁止使用下列药品，也可根据进口国的要求适当增减:a)磺胺类;b)二氯二甲毗吮酚(克球粉);。)氯霉素、甲矾霉素、氟苯尼考;d)莫仑太尔、拉沙洛西，乙酞胺、尼卡巴嗓、卡巴多司、氯丙嗦、冬眠灵、所有激素类及有激素类样作用的物质平喘药(经甲叔丁肾上腺素、盐酸克仑特罗)、性激素、秋水仙碱、促性腺激素、同化激素;具有雌激素样作用的物质(己烯雌酚、玉米赤霉醇)、催眠镇静片(安定、安眠酮)、肾上腺素(异丙肾上腺素、沙丁胺醇、多巴胺及R一肾上腺素激动剂)、强的松、氟美松、地塞米松等;e)唆乙醇、枝原净、氨丙琳、杆菌肤、泰乐菌素;f)四环素、土霉素、强力霉素、金
5、霉素;B)喳诺酮类:氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、双氟沙星、奥比沙星等;h)硝基吠喃类:吠喃哇酮、吠喃他酮、吠喃西林、峡喃妥因;i)其它类:敌菌丹、卡巴氧、二甲硝咪4,氟心消、甲硝哇/灭滴灵、洛硝达哇、甲硝咪哇、罗硝哇、灭滴灵、迪美哇、环己锡、三哇锡、库马福司/蝇毒磷。)金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗琳肛(病毒灵)、等及其单、复方制剂、头抱类、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、磷霉素、伊维菌素，克林霉素、利福霉素及其单、复方制剂、聚肌胞、澳乙新、西咪替丁、=轻丙苯碱、白细胞介素一2041兽药供应企业资质审核肉鸡出口企业每年应对兽药供应企业进行实地全面考察，对兽药供应企业进行资
6、质审核，并且要求提供如下资料:a)企业法人证书、营业执照、税务登记证;b)兽药生产许可证;c)兽药GMP iiE书;d)兽药(注册)批准文号;e)进口兽药登记许可证。6兽药违禁药品检验6.1检测项目肉鸡出口企业购人的所有药品均应由有资质的机构检验，合格后方可投人使用。检验项目包括:硝基峡喃类、氯霉素、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星，磺胺类及四环素族。6.2检验方法6.2.，硝基映喃类按照附录A的规定执行。6.2.2抓霉素按照附录B的规定执行。6.2.3哇诺酮类按照附录C的规定执行。6.2.4四环素族按照附录D的规定执行。DB13/T 1100-20096.2.5砚胶类按照附录E的规定执
7、行。7兽药的供应和使用7.1只有企业检验合格的兽药才能向肉鸡饲养场供应。7.2肉鸡饲养备案场凭企业兽医的处方到兽药供应站购药，兽药供应站按照企业兽医的处方向肉鸡饲养场提供药品。7.3兽药供应站供药员把饲养场所购药品的品名、数量、批号等信息记录在供药卡上，由饲养场负责人签字。7.4企业兽医按照出口企业允许使用兽药说明书上规定的休药期指导肉鸡饲养场用药，并将兽药使用情况记录于饲养记录手册中。8饲料的供应和使用8.1倡导肉鸡出口企业使用的饲料由自有饲料厂生产，所用饲料和饲料添加剂应符合NY 50犯的要求。8.2出口肉鸡所用饲料由公司统一供应备案场使用。8.3出口肉鸡所用饲料分三种:a)小鸡料:在0-
8、19日龄使用;b)中鸡料:在20-34日龄使用;c)大鸡料:在35日龄至出栏使用。8.4饲料的使用本着先进先出的原则。8.5备案场对于使用饲料进行严格登记:饲料品名、生产批号、有效期等。9采样9.1肉鸡出栏前采样9.1.1采样时间:肉鸡出栏前3 d-5 do9.1.2采样数量:样品鸡应健康无病、体重在2 kg以上。采取随机抽样的方法，I万只以下每栋采6只，1万只或1万只以上每栋采12只。9.1.3做好标识，标识要牢固，确保不脱落。9.1.4宰前兽医负责将样品鸡脱毛，而后放在准备好的塑料筐内，逐户取腿肉样不少于500 g，将样品装人包装袋内，在包装袋外用橡皮膏做好样品编号。编号的内容包括:肉鸡养
9、殖户的地址、姓名、采样日期、制样的顺序号。9.1.5宰前兽医将样品送化验室检验，不合格的样品要进行复检，再不合格的拒绝回收肉鸡。9.2肉鸡屠宰厂采样按照NY/T 5344.6-2006中4.3.1.3执行。10鸡肉中违禁药物的检验10.1硝甚映喃类:映喃哇酮、映喃他酮、映喃西林、映喃妥因按照农业部866号公告的规定执行。10.2级.素按照SN/T 1604-2005的规定执行。10.3哇诺酮类:妞奴沙星、环丙沙星、恩诺沙星、诺奴沙星按照DB 35/T 585-2004的规定执行。10.4成胺类DB13/T 1100-2009按照NY 5029-2001中附录E的规定执行。10.5四环素族:四环
10、素、土霉素、金.素、强力.素按照GB/T 20764-2006的规定执行。DB13/T 1100-2009附录A(规范性附录)兽药中四种吠喃类药物残留高效液相色谱一紫外检测法A.1A.2范围本标准规定了兽药中吠喃它酮、峡喃哇酮、峡喃妥因、峡喃西林残留量的原理、仪器、提取和净化。本标准适用于兽药中吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林残留量的测定。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版
11、本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法A.3原理样品中吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、味喃西林用二甲基甲酞胺溶液溶解，用正己烷净化，用高效液相色谱一紫外检测法测定，外标法定量。A.4试荆与材料所用试剂除另有指定外，均为色谱纯。试验用水应符合GB/T 6682中二级水的规定。A.4.，乙睛。A.4.2二甲基甲酞胺溶液。A.4.3正已烷。A.4.4无水硫酸钠:分析纯，经640灼烧4h后，贮于密闭容器中备用。A.4.5吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林标准品:纯度)95.0% oA.4.6吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林标准储备溶液:分别称取吠喃它酮、峡喃哇酮、吠喃妥
12、因、吠喃西林标准品100.0 mg(按实际含量折算)，用甲醇溶解定容于100 mL棕色容量瓶中，此溶液浓度为1 000 5 g/mL。各标准储备溶液置于29C-8冰箱中冷藏保存，保存期为六个月。标准使用液用流动相稀释至适当浓度，现配现用。A.5仪器A.5.1高效液相色谱仪，配有紫外检测器。A.5.2旋转蒸发器。A.5.3离心机。A.5.4涡旋混合器。A.5.5精密分析天平(感量0.000 01 g) ;天平(感量0.01 g) oA.5.6振荡器。A.5.7尼龙微孔过滤膜:歹0.2 NmoA.6色谱条件A.6.1色谱柱:Aglient C18 3.9X250 mm, 5 5m或相当者。DB 1
13、3/T 1100-2009A.6.2流动相:乙睛+甲醇+水+冰醋酸二(138+138+724+5, VN )A.6.3流速:0.4 mUminoA.6.4检测波长:350 nm oA.6.5柱温:4090A.6.6进样量:20 5 L.A.7样品处理A.7.1样品制备固体兽药，在称量前充分摇匀;液体兽药，在量取前充分混合。A.7.2提取与净化A.7.2.1固体西药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL二甲基甲酞胺溶液，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，残渣再用10 mL
14、二甲基甲酞胺溶液溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，振荡3 800 r/min离心8 min后，下层二甲基甲酞胺溶液转人100 mL鸡心瓶中，待浓缩。A.7.2.2固体中药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加人10 mL二甲基甲酞胺溶液，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，残渣再用10 mL二甲基甲酞胺溶液溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，.
15、振荡3 800 r/min离心8 min后，下层二甲基甲酞胺溶液再次加人正己烷20 mL净化一次，去除正己烷相转移至100 mL鸡心瓶中待浓缩。A.7.2.3液体兽药液体状的兽药吸取1 mL于50 mL聚丙烯离心管中，加5g的无水硫酸钠，以下同中药或粉状西药提取净化步骤。上述待浓缩液中加人10 mL正丙醇，50下减压干燥后残留物用2.0 mL流动相定容，转移至离心管中，加人等量的正己烷，3 800 r/min离心10 min。对于中药成分的兽药等量正己烷去杂质3次;对于西药粉剂的兽药等量正己烷去杂质2次;对于液体状的兽药等量正己烷去杂质2次，至下层液体澄清。吸取下层液体用尼龙微孔过滤膜过滤，滤
16、液待测。A.8测定A.8.，标准工作曲线的制作配制吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林混合标准溶液，使得溶液浓度为10.0 5岁mL，分别移取10.0 5g/mL的混合标准溶液10 5L, 20 5L, 50 5L, 100 1L, 200 5L, 500 PL, 1 000 5L用流动相稀释成浓度分别为0.10 5 g/mL, 0.20 5创mL, 0.50 pg/mL, 1.0 5g/mL, 2.0 5创mL, 5.0 5g/mL,10.0 5岁mL的混合标准溶液，供高效液相色谱分析，制作标准工作曲线。A.8.2液相色谱测定根据样品溶液中吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林残留量情况，
17、选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中峡喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、峡喃西林响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积穿插进样进行测定。四种吠喃类药物的检测色谱见图A. 1o四种吠喃类药物的出峰顺序和参考保留时间如下:药物名称 保留时间吠喃它酮4.091 minDB13/T 1100-2009吠喃西林7.881 min吠喃妥因8.319 min吠喃哇酮9.609 minA.8.3空白试验与空白添加回收试验每个试验批次的样品中至少必须同时做空白样品和空白添加样品(实际加人值为已知)。空白鸡肉添加样品的实际加人值水平可选在等于方法检测限0.5 mg/kg或略高的
18、实际加入值水平上操作;空白样品和空白添加样品的测定按步骤7操作。本试验用于计算试验的回收率R,，试验的回收率用于对阳性的残留结果进行残留量的校正。回收率R。按公式(1)计算。Rc二A,-A0 X100%AM(A.1)式中:k代表回收率;An,空白添加样品中四种吠喃类药物残留量测定值，. g/g;A厂一空白样品中四种吠喃类药物残留量测定值，5g/g;Ahr-空白样品中添加四种峡喃类药物含量，gg/mL0试样中吠喃它酮、吠喃哩酮、吠喃妥因、吠喃西林残留量(待校正值)按公式(2)计算。C二.(A-AO)xCs xV x1000As x M(A.2)式中:C样品中吠喃它酮、峡喃哇酮、峡喃妥因、吠喃西林
19、残留量，g g/g;A样品溶液中吠喃它酮、吠喃4酮、峡喃妥因、吠喃西林的峰面积;Ao-空白实验被测物的色谱峰面积;A一标准工作溶液中吹喃它酮、峡喃陛酮、吠喃妥因、吠喃西林的峰面积;C一标准工作溶液中吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林的浓度，5g/mL;V样品定容体积，mL;m样品的克重，goA.9检验报告结果报告值按公式(3)计算。(A.3)式中:C经过回收校正的样品中吠喃它酮、峡喃哇酮、吠喃妥因、峡喃酉林残留量，5g/kg;c未校正的样品中吠喃它酮、峡喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林残留量，5叭g;4一一回收率，%。A.10线性范围吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林在0.10 5 g/g-
20、10.0 5 g/g范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9995.A.11检测限DB 1 3/T 1100-2009吠喃它酮、吠喃哇酮、吠喃妥因、吠喃西林的检测限为0.50 mg/kgo史招切陇铡瞥侈6布司。四翻瞥攀尸留，L林阁谬侈.。“;。!八从o.以龙0.(洲)峭jR 0.ooro.o发0.0012幻3(刀41】冬5.(刀6以)7.009.11)10.00，00120013.0014.00图A.1四种肤喃类检测色谱图DB13/T 1100-2009附录B(规范性附录)兽药中氮舞素残留检测范围本标准规定了兽药中氯霉素残留检测的原理、仪器、提取和净化。本标准适用于兽药中氯霉素残留的测定。
21、规范性引用文件J.2BB下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法B.3原理兽药中氯霉素用乙睛提取，正己烷净化，高效液相色谱一紫外检测法测定，外标法定量。BA试剂与材料所用试剂除另有指定外，均为色谱纯。试验用水应符合GB/T 6682中二级水的规定。B.4.1乙睛。B.4.2正已烷。B.4.3无水硫酸钠:分析纯，经640灼烧4h后，贮于密闭
22、容器中备用。B.4.4氯霉素标准品:纯度)95.0%0B.4.5氯霉素标准储备溶液:称取氯霉素标准品100.0 mg(按实际含量折算)，用乙睛溶解定容于100 ML棕色容量瓶中，此溶液浓度为1 000 5g/mL，于2cC 8冰箱中冷藏保存，保存期为六个月。标准使用液用流动相稀释至适当浓度，现配现用。B.5仪器B.5.1B.5.2B.5.3B.5.4B.5.5B.5.6B.5.7高效液相色谱仪，配有紫外检测器。旋转蒸发器。离心机。涡旋混合器。精密分析天平(感量0.000 01 g) ;天平(感量0.01 g)0振荡器。尼龙微孔过滤膜:f 0.2 5m0B.6色谱条件B.6.1B.6.2B.6.
23、3B.6.4色谱柱:Aglient C 18 3.9 X 250 mm, 5 5 m或相当者。流动相:乙睛+甲醇+水+冰醋酸二(138+138+724+5, VN) 0流速:0.5 mUmin0检测波长:280 nm 0DB13/T 1100-2009B.6.5B.6.6柱温:4090进样量:20匹。B.7样品处理B.7.1样品制备固体兽药，在称量前充分摇匀;液体兽药，在量取前充分混合。B.7.2提取与净化B.7.2.1固体西药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加人10 mL乙睛，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10
24、 min，上清液转入另一个离心管中，残渣再用10 mL乙睛溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，振荡3 800 r/min离心8 min后，下层乙睛层转人100 mL鸡心瓶中，待浓缩。B.7.2.2固体中药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加人10 mL乙睛，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，残渣再用10 mL乙腊溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去
25、杂质，振荡3 800 r/min离心8 min后，下层乙睛层再次加人正己烷20 mL净化一次，去除正己烷相转移至100 mL鸡心瓶中待浓缩。B.7.2.3液体兽药液体状的兽药吸取1 mL于50 mL聚丙烯离心管中，加5g的无水硫酸钠，以下同中药或粉状西药提取净化步骤。于上述待浓缩液中加人正丙醇10 mL, 50下减压干燥，残留物用95%乙睛3 mL溶解超声5 min,过Sep-Pak氧化铝柱，再取5 mL 95%乙睛溶解鸡心瓶中的残留物后加人Sep-Pak氧化铝柱中，待液体流净后用70%乙睛10 mL洗脱并收集到鸡心瓶中。上述洗脱液中加人5 mL正丙醇，50下减压干燥后残留物用2.0 mL流动
26、相定容，转移至离心管中，加人等量的正己烷，3 800 r/min离心10 min。对于中药成分的兽药等量正己烷去杂质3次;对于西药粉剂的兽药等量正己烷去杂质2次;对于液体状的兽药等量正己烷去杂质2次，至下层液体澄清。吸取下层液体用尼龙微孔过滤膜过滤，滤液待测。B.8测定B.8.1标准工作曲线的制作配制氯霉素标准溶液，用流动相稀释成浓度分别为0.050 5g/mL, 0.10 5g/mL, 0.20 5g/mL,0.50。咖L, 1.0 5g/mL, 5.0。岁mL的标准溶液，供高效液相色谱分析，制作标准工作曲线。B.8.2液相色谱测定根据兽药中氯霉素的残留量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。
27、标准工作溶液和样品溶液中氯霉素的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积穿插进样进行测定。氯霉素检测色谱图见图B.2.氯霉素参考保留时间如下:药物名称 保留时间氯霉素17.355 minB.8.3空白试验与空白添加回收试验每个试验批次的样品中至少必须同时做空白样品和空白添加样品(实际加人值为已知)。空白兽药添加样品的实际加人值水平可选在方法检测限0.20 5吮或略高的实际加人值水平上操作;空白样品和空白添加样品的测定按步骤7操作。本试验用于计算试验的回收率R,，试验的回收率用于对阳性的残DB13/T 1100-2009留结果进行残留量的校正。回收率R。按公式(1)计算。凡
28、=.生竺0-x100%AM(B.1)式中:R代表回收率;A.-空白添加样品中氯霉素残留量测定值，5眺;Ac空白样品中氯霉素残留量测定值，5g/g;A一空白样品中添加抓霉素药物含量，gg/rL;试样中氯霉素的残留量(待校正值)按公式(2)计算。C=.(竺鱼竺丘些x 1000AS X M(B.2)式中:C样品中抓霉素残留量，Ng/g;A样品溶液中氯霉素的峰面积;Ao一一空白试验被测物的峰面积;A一标准工作溶液中抓霉素的峰面积;C一标准工作溶液中抓霉素的浓度，gg/mL;V样品定容体积，mL;m-样品的克重，goB.9检验报告结果报告值按公式(3)计算。(B.3)式中:C经过回收校正的样品中氯霉素残
29、留量，5g/kg;C未校正的样品中抓霉素残留量，Ng/kg;9-回收率，%。B.10线性范围氯霉素在0.050 5吮,5.0 5 g/g范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9995.B.11检测限兽药中氯霉素的检测限为:0.20 5g/go11DB13/T 1100-2009组椒介卜尸。翻嘴璐人日曰Q QQ 灵气、tl、1，“，/一叨呱9.00 10.00 11.田1200 1300 14.田15.00低田17.00 18.田19.00 20.00 21.00 2200分钟图B. 2氮霉素检测色谱图12DB 1 3/T 1100-2009附录C(规范性附录)兽药中氮哇诺酮类检测一高效液相
30、色谱法范围本标准规定了兽药中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量的原理、仪器、提取和净化。本标准适用于兽药中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量的测定。规范性引用文件月.2CC下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法C.3原理兽药中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星用乙睛提取，用正己烷净化，用高效液相色谱-荧光检测法测
31、定，外标法定量。C.4试荆与材料所用试剂除另有指定外，均为色谱纯。试验用水应符合GB/T 6682中二级水的规定。C.4.1乙睛。C4.2正已烷。C.4.3无水硫酸钠:分析纯，经640灼烧4h后，贮于密闭容器中备用。C.4.4 0.01 mol/L四丁基嗅化钱溶液(pH=3.0)，称取3.22 g四丁基澳化按，用1 000 mL水稀释，冰醋酸调解pH值到3.00C.4.5恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星标准品:纯度95.0%0C.4.6恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星标准储备溶液:分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星标准品10.0 mg(按实际含量折算)，用0.03 mo
32、l/L NaOH溶液10 mL溶解，再用乙睛稀释定容于100 mL棕色容量瓶中，此溶液浓度为100 5g/mL。各标准储备溶液置于2cC-8冰箱中冷藏保存，保存期为六个月。标准使用液用流动相稀释至适当浓度，现配现用。C.5仪器C.S.，高效液相色谱仪，配有荧光检测器。C.5.2旋转蒸发器。C.5.3离心机。C.5.4涡旋混合器。C.5.5精密分析天平(感量0.000 01 g);天平(感量0.01 g).C.5.6振荡器。C.5.7尼龙微孔过滤膜:“0.2 5m0C.6色谱条件DB13/T 1100-2009C.6.1色谱柱:Aglient C 18 4.6 X 250 mm, 5 5 m或相
33、当者。C.6.2流动相:0.01 mol/L四丁基澳化钱(pH=3.0)+乙睛二(96.2+3.8, V/V )C.6.3流速:1.2 mUminoC.6.4检测波长:激发波长280 nm，发射波长450 nm0C.6.5柱温:40T.C.6.6进样量:20 5L0C.7样品处理C.7.1样品制备固体兽药，在称量前充分摇匀;液体兽药，在量取前充分混合。C.7.2提取与净化C.7.2.1固体西药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加人10 mL乙睛，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，
34、残渣再用10 mL乙睛溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，充分振荡，3 800 r/min离心8 min后，下层乙睛层转人100 mL鸡心瓶中，待浓缩。C.7.2.2固体中药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL乙睛，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，残渣再用10 mL乙睛溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，充分振荡，3 800 r
35、/min离心8 min后，下层乙睛层再次加人正己烷20 mL净化一次，去除正己烷相转移至100 mL鸡心瓶中待浓缩。C.7.2.3液体兽药液体状的兽药吸取1 mL于50 mL聚丙烯离心管中，加5g的无水硫酸钠，以下同中药或粉状西药提取与净化步骤。于上述待浓缩液中加人正丙醇10 mL, 50下减压干燥，残留物用2.0 mL流动相定容，转移至离心管中，加人等量的正己烷，3 800 r/min离心10 min。对于中药成分的兽药等量正己烷去杂质3次;对于西药粉剂的兽药等量正己烷去杂质2次;对于液体状的兽药等量正己烷去杂质2次，至下层液体澄清。吸取下层液体用尼龙微孔过滤膜过滤，滤液待测。C.8测定C.
36、8.1标准工作曲线的制作配制恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星混合标准溶液，使得溶液浓度为1.0 5g/mL(其中氧氟沙星浓度为3.0 5 g/mL)，分别移取1.0 5 g/mL的混合标准溶液10 5L, 20 5L, 50 5L, 500 5L,1 000 5L，用流动相稀释成浓度分别为0.010 5g/mL, 0.020 pg/mL, 0.050 5g/mL, 0.50 5g/mL,1.0 5g/mL的混合标准溶液，供高效液相色谱分析，制作标准工作曲线。C.8.2液相色谱测定根据样品溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样
37、品溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积穿插进样进行测定。四种氟喳诺酮类检测色谱图见图C.10四种氟喳诺酮的出峰顺序和参考保留时间如下:DB13/T 1100-2009药物名称 保留时间氧氟沙星7.595 min诺氟沙星9.396 min环丙沙星11.180 min恩诺沙星16.313 minC.8.3空白试验与空白添加回收试验每个试验批次的样品中至少必须同时做空白样品和空白添加样品(实际加人值为已知)。空白兽药添加样品的实际加人值水平可选在方法检测限0.050 5g/mL或略高的实际加人值水平上操作;空白样品和空白添加样品的
38、测定按步骤7操作。本试验用于计算试验的回收率Rc，试验的回收率用于对阳性的残留结果进行残留量的校正。回收率R。按公式(1)计算。Rc一A,-Ao X100%Am(C.1)式中:民二代表回收率;A一空白添加样品中四种氟喳诺酮类药物残留量测定值，5眺;Ao-空白样品中四种氟哇诺酮类药物残留量测定值，5g/g;A二空白样品中添加四种氟喳诺酮类药物含量，9 g/mL;试样中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量(待校正值)按公式(2)计算。(A一式)XCS xV_，八八八L=xiuuuAS x M式中:C样品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留量，N g/g;A样品溶液中氧氟沙星、诺氟沙
39、星、环丙沙星、恩诺沙星的峰面积;Ao空白实验被测物的色谱峰面积;A一标准工作溶液中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的峰面积;C一标准工作溶液中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的浓度，P创mL;V样品定容体积，mL;m样品的克重，goc.9检验报告(C.2)结果报告值按公式(3)计算。(C.3)式中:C经过回收校正的样品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量, 5g/kg;c未校正的样品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量,5叭g;尺回收率.%。C.10线性范围氧氟沙星在0.03 5留mL-3.0 5g/mL范围内呈良好的线性关系，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星在0.
40、010 5g/mL-1.0 5 g/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 8 015DB 1 3/T 1100-2009C.11检测限兽药的检测限:恩诺沙星为0.05 5g/ML，环丙沙星为0.05 5 g/mL，诺氟沙星为0.05 5g/mL,氧氟a为0.15 4g/mL0自动标尺色谱图6o no40 DO3OnO20 DO10DO0.000.仪峨00e.DOS DO10.005t 9t12.0014D020.0图C.1四种奴哇诺酮类检测色谱图16DB 1 3/T 1100-2009附录D(规范性附录)兽药中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留检测范围本标准规定了兽药中土霉素
41、、四环素、金霉素、强力霉素残留检测的原理、仪器、提取和净化。本标准适用于兽药中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的测定。规范性引用文件J.2DD下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法D.3原理兽药中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素用甲醇提取，正己烷净化，高效液相色谱一紫外检测法测定，外标法定量。D.4试荆与材料所用试剂除另有指定外，均
42、为色谱纯。试验用水应符合GB/T 6682中二级水的规定。D.4.1甲醇。D.4.2正己烷。D.4.3无水硫酸钠:分析纯，经640灼烧4h后，贮于密闭容器中备用。D.4.4草酸。D.4.5土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准品，纯度)95.0%0D.4.6土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液:分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素100.0 mg(按实际含量折算)，用甲醇溶解定容于100 mL棕色容量瓶中，此溶液浓度为1 000 5咖L,于29C -8冰箱中冷藏保存，保存期为六个月。标准使用液用流动相稀释至适当浓度，现配现用。D.5仪器D.5.1D.5.2D.5.3D.5.4D.5.
43、5D.5.6D.5.7高效液相色谱仪，配有紫外检测器。旋转蒸发器。离心机。涡旋混合器。精密分析天平(感量0.000 01 g) ;天平(感量0.01 g) o振荡器。尼龙微孔过滤膜:f0.2 5m0D.6色谱条件D.6.1D.6.2色谱柱:Aglient C 18 4.6 X 250 mm, 5 5 m或相当者。流动相:乙睛+甲醇+0.01 mol几草酸溶液(2+1+7).DB13/T 1100-2009D.6.3流速:0.7 mUminoD.6.4检测波长:350 nmoD.6.5柱温:2790 oD.6.6进样量:60 I L.D7.样品处理D.7.1固体样品制备固体兽药，在称量前充分摇匀
44、;液体兽药，在量取前充分混合。D.7.2提取与净化D.7.2.1固体西药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加人10 mL甲醇，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，残渣再用10 mL甲醇溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，充分振荡，3 800 r/min离心8 min后，下层甲醇层转人100 mL鸡心瓶中，待浓缩。D.7.2.2固体中药成分兽药准确称取兽药样品1.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL甲醇
45、，用超声波超声10 min后在振荡器上振荡20 min, 3 800 r/min离心10 min，上清液转人另一个离心管中，残渣再用10 mL甲醇溶解，振荡10 min, 3 800 r/min离心10 min，合并两次上清液用20 mL正己烷去杂质，充分振荡，3 800 r/min离心8 min后，下层甲醇层再次加人正己烷20 mL净化一次，去除正己烷相转移至100 mL鸡心瓶中待浓缩。D.7.2.3液体兽药液体状的兽药吸取1 mL于50 mL聚丙烯离心管中，加5g的无水硫酸钠，以下同中药或粉状西药提取与净化步骤。于上述待浓缩液中加人正丙醇10 mL, 50下减压干燥，残留物用2.0 mL流
46、动相定容，转移至离心管中，加人等量的正己烷，3 800 r/min离心10 min。对于中药成分的兽药等量正己烷去杂质3次;对于西药粉剂的兽药等量正己烷去杂质2次;对于液体状的兽药等量正己烷去杂质2次，至下层液体澄清。吸取下层液体用尼龙微孔过滤膜过滤，滤液待测。D.8测定D.8.1标准工作曲线的制作配制土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准溶液，使得浓度为20.0 5 g/mL(其中金霉素和强力霉素分别为60.0 gg/mL)用流动相稀释成浓度分别为0.10 5g/mL, 0.50 .tg/mL, 1.0 5g/mL,2.0。咖L, 5.0 5g/mL, 10.0 5g/mL的混合标准溶液，
47、供高效液相色谱分析，制作标准工作曲线。D.8.2液相色谱测定根据兽药中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的残留量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积穿插进样进行测定。四种四环素族检测色谱图见D.10四种四环素族参考保留时间如下:药物名称 保留时间土霉素5.137 min四环素5.853 min金霉素10.880 min强力霉素15.474 minDB13/T 1100-2009D.8.3空白试验与空白添加回收试验每个试验批次的样品中至少必须同时做空白样品和空白添加样品(实际加人
48、值为已知)。空白兽药添加样品的实际加人值水平可选在方法检测限0.50 Ng/g或略高的实际加入值水平上操作;空白样品和空白添加样品的测定按步骤7操作。本试验用于计算试验的回收率Rc，试验的回收率用于对阳性的残留结果进行残留量的校正。回收率R。按公式(1)计算。R,=竺m -. A0)、100%AM(D.1)式中:Rc代表回收率;A.-空白添加样品中四种四环素族残留量测定值，xg/g;A一空白样品中四种四环素族残留量测定值，5 g/g;A二空白样品中添加四种四环素族药物含量，5g/mL;试样中四种四环素族的残留量(待校正值)按公式(2)计算。C=(A-Ak)xCs xV x1000As x m(
49、D.2)式中:C样品中四种四环素族残留量，N g/g ;A样品溶液中四种四环素族的峰面积;Ao一一一空白试验被测物的峰面积;A一标准工作溶液中四种四环素族的峰面积;C一标准工作溶液中四种四环素族的浓度，5 g/mL;V样品定容体积，mL;m样品的克重，goD.9检验报告结果报告值按公式(3)计算。_CL，=R,(D.3)式中:c-一经过回收校正的样品中四种四环素族残留量，5 g/kg ;c一一未校正的样品中四种四环素族残留量，5g/kg;冬.回收率，%。D.10线性范围土霉素、四环素在0.10 5 g/g -10.0 5 g/g范围内呈良好的线性关系，金霉素、强力霉素在0.30 5g/g30.0 5g/g范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 5.D.11检测限固体兽药或液体兽药中的土霉素、四环素的检测限为:0.50 5吮;金霉素、强力霉素的检测限为:1.5 5吮。19DB13/T 1100-20090.020寸卜寸.的护。服枯只哪0.015oe。.。，暇
