1、ICS 65.020.40 B 62 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 2422 2016 高山杜鹃工厂化育苗技术规程 2016 - 09 - 30 发布 2016 - 12 - 01 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2422 2016 I 前 言 本 标准 按照 GB/T 1.1-2009给出的规 则起草。 本标准 由石家庄市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：石家庄市农林科学研究院 。 本标准主要起草人：蒋淑磊、李志斌、李国松、李振勤、白霄霞、徐立军、边光亚。 DB13/T 2422 2016 1 高山杜鹃工厂化育苗技术规程 1 范 围 本标准规定了高山杜鹃工厂
2、化育苗生产的组织培养车间的设计、主要仪器设备、组培生产流程、炼苗移栽、质量分级及包装、标志、运输等内容。 本标准适用于高山杜鹃工厂化繁育生产、管理的全过程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2306-2013 花卉 种苗组培快繁技术规程 。 3 组培车间与育苗区设计 3.1 设计要求 3.1.1 组培车间应建在干燥、通风透光、空气清新的地点。 3.1.2 组培车间主要 包括 :洗涤室、药品室（称量室）、培养基配制室、灭菌室、培养基储备室、接
3、种室、 培养室 等。 3.1.3 育苗区主要包括炼苗室和 温室大棚 。 3.2 面积要求 不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求见表 1 表 1 不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求 单位： m2 名 称 面积指标 年产 5 万株 年产 10 万株 年产 20 万株 组培车间 200 300 370 450 700 800 洗涤室 12 15 20 30 40 50 培养瓶晾干室 5 10 20 30 40 50 药品 室 (称量室 ) 12 15 20 30 20 30 培养基配制室 12 15 20 30 40 60 DB13/T 2422 2016 2 表 1 不同规模的高
4、山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求 （ 续） 单位： m2 名 称 面积指标 年产 5 万株 年产 10 万株 年产 20 万株 灭菌室 5 10 20 30 20 30 培养基储存室 10 15 20 30 40 60 接种室 20 25 50 80 100 120 培养室 60 80 150 250 300 400 出苗室 20 30 20 30 40 50 育苗区 750 900 1500 2000 3000 3500 炼苗室 15 20 20 30 30 50 温室大棚 700 800 1000 1200 2000 3000 4 仪器设备及试剂 所需的仪器设备及试剂主要包括：灭菌设备、接
5、种设备、培养设备和组培常规试剂。不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂见表 2。 表 2 不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂 名 称 数量指标 年产 5万株株 万株 年产 10 万株 万株 年产 20 万株 万 株 灭菌设备、器械 50 L 立式高压灭菌器 1 1 1 360 L 卧式高压蒸汽 灭菌器 0 1 2 干燥灭菌器 8 16 32 电热干燥箱 50 cm 60 cm 75 cm 1 1 1 40 W 紫外灯 若干 若干 若干 接种设备及器械 超净工作台（单人） 8 16 32 酒精灯 8 16 32 镊子 16 32 64 手术刀柄 16 32 64 不锈钢碟 80
6、160 320 培养设备和培养容器 空调 5 10 20 培养架 50 100 200 DB13/T 2422 2016 3 表 2 不同规模高山 杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂 （续） 名 称 数量指标 年产 5万株株 万株 年产 10 万株 万株 年产 20 万株 万株 组培专用托盘 1500 3000 6000 250 mL 培养瓶 6 万 12 万 24 万 其它 0.1 mg/0 210 g 电子分析天平 1 1 1 0.01 g/0 6000 g 电子精密天平 1 1 1 pH 计 1 1 1 温度计 5 10 20 200 L 冰箱 1 2 3 电磁炉 1 2 2 双层小推车
7、5 10 20 小型去离子水设备 10-100 L 1 1 1 试剂 WPM 基本培养基组成成分试剂和 植物生长物质 玻璃器皿 烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶等 5 组培生产流程 5.1 品种选择与母本材料管理 5.1.1 品种选择 选择适应性强，观赏价值高的高山杜鹃品种，例如：粉金蝶（ Rhododendron hybrids cv Cosmopolitan） ，红粉佳人（ Rh. cv. Nova Zembla ），马缨花（ Rh. Fr） 。 5.1.2 母本材料管理 将高山杜鹃母本植株种植在特定区域，加强肥水管理，防治和减少植株表面附带的病虫害。 5.2 培养基选择与母液 配制 5.2.1
8、 培养基选择 以 WPM和 1/2 WPM为基本培养基。 5.2.2 母液的配制 制作培养基前需先配制基本培养基母液， WPM培养基母液配制比例见表 3。 DB13/T 2422 2016 4 表 3 WPM 培养基母液配制 种类 成分 称取量 （ mg） 母液体积 （ ml） 配 1 升培养基 吸取量（ ml） 大 量 元 素 NH4NO3 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KH2PO4 KNO3 K2SO4 4000 1320 3700 1700 4000 9000 1000 100 中 量 元 素 镁 MgSO4.7H2O 3700 1000 100 钙 CaCl2. Ca(NO
9、3)24H 2O 960 5560 微 量 元 素 螯合铁 Na2-EDTA FeSO4.7H2O 3730 2780 500 5 H3BO3 MnSO4.H2O Na2MoO42H 2O CuSO4.5H2O ZnSO47H 2O 310 1115 12.5 1.25 430 500 10 维 生 素 肌醇 烟酸（维生素 PP） 盐酸吡多醇 盐酸硫胺素 甘氨酸 5000 25 25 25 100 500 10 注 ： 母液 配制应用去离子水，置于 4左右冰箱保存，贴好标签，注明名称、配制日期。 5.3 植物生长物质的母液配制 5.3.1 植物生长物质的母液配制浓度 1.0 mg/ml，植物生
10、长物质的母液配制方法见表 4。 表 4 植物生长物质的母液配制方法 类 别 种 类 常用浓度（ mg/ml） 细胞分裂素 2ip（ 异戊烯基腺嘌呤） 1.0 生长素 IAA（ 吲哚乙酸） 1.0 IBA（ 吲哚丁酸） 1.0 NAA（ -萘乙酸） 1.0 DB13/T 2422 2016 5 5.3.2 配制方法：先用少量 0.1 mol/L 的 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。 5.3.3 保存要求：母液配制好后 贴好标签，置于 4左右的冰箱内，保存期应不超过 2 个月 。 5.4 培养基制作 5.4.1 制作 取预配母液，加入激素，充分搅拌均匀，用去离子水定容 1升，加入琼脂 6.5 g
11、/L，砂糖 30 g/L，加热溶解。测 pH值，用 0.1 mol/L的 HCl或 0.1 mol/L的 NaOH调节 pH值至 5.4 5.6。 5.4.2 分装 根据不同需要定量分装，一般要求占瓶 20 25 % 的比例，分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口，盖好瓶盖。 5.5 高压灭菌 5.5.1 分装后的培养基应在 10 h 内通过高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌要求 121 灭菌 20 min。 5.5.2 合格的灭菌培养基，应注明灭菌日期，合格标志。 5.5.3 灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量，将配制好的培养基放置
12、 5 d 左右观察再用，且贮存时间不应超过一个月 。 5.6 外植体 从健壮植株上选取生长饱满的花蕾为外植体；也可采用茎芽为外植体。 5.6.1 材料预处理 将外植体剪取适当大小，用洗涤剂溶液浸泡并振荡 5 min 10 min，然后自来水冲洗 30 min。 5.6.2 外植体消毒 在超净台上将预处理后的外植体放入有盖容器中，倒入 75%酒精使之没过外植体，并轻摇以除去气泡，浸泡 30 s，倒去酒精，用无菌水冲洗外植体 5次。倒入 0.1 % 的 HgCl2使之没过外植体，根据外植体材料的质量和大小，在 HgCl2溶液中浸泡 2 min 3 min，处理过程中不断轻摇，将外植体表面的气泡除去
13、，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗 3 5次后备用。 5.7 接种准备及外植体接种操作 接种准备和外植体接种操作规范按照花卉 种苗组培快繁技术规程 执行 。 5.8 组织培养过程 5.8.1 培养室条件 培养温度为 20 22 ，光照强度 3000 lux 3500 lux，每日光照 12 h。 5.8.2 初代培养基 初代培养的培养基配方为 :WPM+ 2ip6.0 mg/L +白砂糖 30 g/L+琼脂 6.5 g/L， pH值调至 5.4 5.6。 5.8.3 继代培养基 DB13/T 2422 2016 6 培养 1周后，花托基部开始膨大，培养 6周后，长出淡黄或浅绿光滑的愈伤组织
14、块，继续转接在 WPM+ 2ip6.0 mg/L +白砂糖 30 g/L+琼脂 6.5 g/L培养，长出丛生芽。 5.9 不定芽分化与增殖培养 5.9.1 不定芽分化与增殖培养基 诱导不定芽分化与增殖的培养基配方 : WPM+2ip2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+白砂 30 g/L+琼脂 6.5 g/L，pH值调至 5.4 5.6。 5.9.2 丛生芽切割 5.9.2.1 先打 开培养瓶盖，瓶口向内，取出的丛生芽块放于有无菌盘上切割； 150 mL 的培养瓶的增殖培养切芽接种数量 5 块 /瓶。 在瓶内排放均匀、整齐。 5.9.2.2 每取一丛生芽块并完成切割和接种后，将接种盘连同切
15、苗过程中的废弃物放到一大接种盘内，同时更换新的无菌接种盘 。 5.10 组培苗生根 将高度为 2 cm 3 cm的丛生苗直接接种于生根培养基中，诱导生根的培养基配方 : 1/2WPM+ IBA4 mg/L +IAA0.5 mg/L +白砂糖 30 g/L+琼脂 6.5 g/L， pH值调至 5.4 5.6。在 150 mL的培养瓶接种数量 8株 /瓶。生根 培养 30 d后，幼苗基部长出 4 7条新根，当根长到 3 cm 4 cm长时，就可进行炼苗移栽。 5.11 污染防治 污染防治方法参见附录 A。 5.12 组培苗质量标准 评价组培苗质量标准参考附件 B。 6 炼苗与移栽 6.1 炼苗：将
16、生根瓶苗从培养室中取出，置于炼苗室中进行自然光适应性锻炼，温度控制在 20 22，经过 3 4 d 的闭口锻炼后， 之后打开培养瓶，炼苗 5 7 d 再进入移栽阶段 。 6.2 移栽 6.2.1 清除培养基 从瓶中轻轻取出组培苗，放在室温的温水中，将附着在根上的培养基清洗掉，洗时注意不能伤根，然后放入另一盆加入 1 % 多菌灵杀菌剂的温水中浸泡 5 min，进行移 栽。 6.2.2 基质准备 将 0.1 mm 0.3 mm的珍珠岩与草炭土按照 1:3混合装入穴盘中，用细眼喷壶将基质喷湿，使基质含水量达到 60 % 左右。 6.2.3 移栽 在穴盘中挖深度 3 4 cm，将试管苗的根部顺延下去，
17、用两手边合边压实。 DB13/T 2422 2016 7 6.2.4 喷水 移栽后用细喷雾器喷水，冲洗叶片上可能粘着的基质，并使根系和基质紧密接触。 6.2.5 插牌 分品种、日期，插牌记录。 6.2.6 移栽后的管理 6.2.6.1 保温保湿 用薄膜小拱棚保温保湿，保持相对湿度在 80 % 左右，温度保持在 18 22之间。薄膜小拱棚可适时通风 0.5 h 1 h。光照强度控制 5000 lux 10000 lux，当试管苗再生新根后可完全打开薄膜小拱棚，自然光照强度，降低空气湿度至 60 % 左右。 6.2.6.2 施肥 为使试管苗健壮，当试管苗正常生长后，可进行叶面喷肥，喷施 1/10
18、MS培养基溶液加 0.1 % 的 H2PO4溶液。 6.2.6.3 病虫防治 温室使用前彻底消毒，用硫磺、百菌清烟雾剂熏蒸 3-4次，温室使用后经常用福尔马林、来苏水消毒。加强通风，每隔 7 d喷一次广普性杀菌剂。 一旦发现虫害、病害及时药物治疗。 6.3 移栽苗的质量标准 移栽苗的质量标准参见附录 C 7 包装、标志和运输 7.1 包装 当试管苗根系发达、植株 健壮、叶片宽度达到 10 cm左右即可出苗， 把穴盘苗装在泡沫盒中，注意留有通气孔。 7.2 标志 每箱应贴上标签，注明品种、等级、规格、数量、产地、出苗日期等。 7.3 运输 装车时切勿倒置，以避免日晒、雨淋，运输途中温度保持 10
19、 15 ， 5 d内到达目的地。 DB13/T 2422 2016 8 附录 A （资料性附录） 组培污染防治 A.1 母瓶 A.1.1 母瓶检查 提取母瓶时要仔细检查母瓶是否污染，若发现污染母瓶应立即剔除。 A.1.2 母瓶预处理 按生产计划提取母瓶，表面喷 75 % 的酒精后，用无菌纱布擦净，放于操作台旁备用，接种过程中若 发现母瓶污染则立即封口。 A.2 切割培养皿的取放 用无菌镊子从棉布包里取出接种盘放在超净工作台面上，应注意手不能接触盘的边沿。 A.3 污染检查 A.3.1 所有污染材料不应在培养室、接种室及中央走廊内开启瓶盖并应在发现当天送到洗涤室。对细菌污染的生根瓶苗可转移到炼苗
20、室移栽。 A.3.2 对处理情况进行数据记录和简要分析原因，并反馈给操作人员 。 A.4 培养室内清洁、消毒 A.4.1 每周用 75 % 的酒精溶液作喷雾降尘处理。每周用消毒液抹地板、门窗等 。 每隔一周用紫外灯或臭氧发生器消毒 30 min。 A.4.2 如培养室有通风装置（如安装有换气扇等）的可用熏蒸剂熏蒸，每月 1 次 。 DB13/T 2422 2016 9 附录 B （资料性附录） 组培苗质量标准 B.1 整体感 苗粗壮、叶片大小协调、有层次感、色泽正常，叶色具原品种特性，无玻璃化。 B.2 根系状况 有新鲜根系（一般 3条以上），长势好、色白健壮，根长适中，无愈伤组织。 B.3
21、苗高 苗高适中，一般 4 cm 6 cm。 B.4 叶片数 具有适宜和正常的叶片数，一般不少于 5片。 B.5 整齐度 同一批次 90 % 以上的苗高达到要求的高度。 B.6 培养基污染状况 无污染。 DB13/T 2422 2016 10 附录 C （资料性附录） 移栽苗的质量标准 C.1 整体感 苗健壮、挺拔和新鲜，形态完整、叶片大小协调，叶色具原品种特性、有光泽。 C.2 根系状况 应具有完整而发达的根系。 C.3 苗高 一般 10 cm 15 cm。 C.4 叶片数 具有较多的叶片数，一般 7 片以上。 C.5 整齐度 同一批次 90 % 以上的苗高达到要求 的高度。 C.6 病虫害损伤 无检疫性病虫害，亦无病虫害危害斑点 。 _
