1、动物生理学实验报告 Page 1 实验五：血液凝固及其影响因素 实验人： 同组人： 【实验目的】 1 学习血液凝固的基本过程 2 了解加速或延缓血液凝固的一些因素 【实验原理】 血液凝固是一个酶的有限水解激活过程，在此过程中有多种凝血因子参与。根据凝血 过程起动时激活因子来源不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性激活途径是指参与血液凝固的所有凝血因子在血浆中，外源性激活途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的激活过程。 【实验材料和用具】 家兔 清洁小试管 7个、小烧杯 2个、竹签、秒表、试管架、哺乳动物手术器械一套、兔手术台、动脉夹、
2、塑料动脉插管、线、棉花、水浴槽、冰盒 液状石蜡、肝素、草酸钾 12mg、脑匀浆液 0.1ml、生理盐水 【实验过程】 1、 动物麻醉及颈部手术 （此部由助教老师操作） 取一只动物 ，称重。按 1g/kg体重的剂量将乌拉坦（氨基甲酸乙酯）由耳缘静脉缓慢注入，观察动物肌张力、呼吸与角膜反射的变化。动物麻醉后背位固定于兔手术台上。 剪去颈部手术野的毛，沿颈正中线在喉头上一指至锁骨上一指的地方作一 5 7cm的皮肤切口。分离皮下组织及肌肉。 2、 颈总动脉插管 （此部由助教老师操作） 在气管两侧辨别并分离颈总动脉，颈总动脉下方穿两条线备用。在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹，在动脉夹远心端距动脉夹约 3
3、cm处结扎。用小剪刀在结扎线的近侧（结扎线与动脉夹之间）沿向心方向剪一小斜口（约占管径的一半），向心脏方向 插入动脉插管，由备用的线结扎固定。取血时将动脉夹松开即可。 3、 血液凝固的加速和延缓 观察 1. 打开兔颈总动脉夹，血液从动脉插管流出，弃去第一份 1mL动脉血后，向每个试管中注入 1mL兔动脉血，并摇匀。 2. 自血液流出动脉插管开始计时。除第 1 管外，其他各管每隔 15 秒钟将试管倾斜一次，观察液面是否倾斜即血液是否流动，直到试管内血液不再流动为止，记录凝血时间。 3. 当第 2管已经凝固时，再倾斜第 1管看血液是否凝固，若尚未凝固则按上述方法每隔 15 秒钟倾斜一次，直到血液凝
4、固为止，记录凝血时间，即为该兔血的凝固时间。 4. 以第 2管为对照，各管 观察其他各管中血液凝固时间。 5. 向第 9管中滴加 2氯化钙 2滴，观察血液是否凝固。 6. 取出第 5管中的玻棒，用水洗净，观察附着在玻棒上的纤维蛋白。 注意事项： 动物生理学实验报告 Page 2 a) 取放试管时要用拇指和食指捏住试管的上端，不要握住试管的底部，以免手的温度影响结果。 b) 每支试管口径及采血量要尽量一致，不可相差太大。 c) 记录凝血时间要准确。 d) 判断凝血的标准要前后一致。一般以倾斜试管达 45时，试管内血液不见流动为准。 【实验结果及相关讨论】 管号 实验条件 凝血时间 （一组） 凝血
5、时间 （二组） 现象解释 1 加入 0.1肝素溶液0.1mL（ 6滴） 大于20min 大于20min 肝素是抗凝剂，能不可逆的阻止血液凝固。 由于肝素钠具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶（ AT-）结合，而增强后者对活化的 a、 a、 a、 a和 a凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。中和组织凝血活素（因子）。抑制血小板的聚集和释放。它对血中有机成分和无机成分的测定均无影响。 2 加入 2草酸钾溶液0.1mL
6、 （ 6滴） 大于20min 血液凝固的多个环节中都需要钙离子的参与，故通常用枸橼酸钠、草酸钠和草酸钾作为体外抗凝剂，它们可与钙离子结合而除去血浆中的钙离子，从而起到抗凝作用 。理论上当继续向血液中加入 CaCl2溶液， CaCl2中的钙离子会起到 凝血因子 IV 的作用， 从而使再次启动凝血过程，血液凝固。草酸盐是可逆性抗凝剂。但本次实验中加入 CaCl2后并没有出现凝血现象，可能是 CaCl2溶液配置有问题，或者由于操作不当，凝血因子已经完全失活。 3 室温（ 6滴生理盐水） 静置 7min30s 7min30s 血液流出血管后，很快会凝固。血液流出血管后血小板 4 室温（ 6滴生理盐水）
7、 每隔 15S 倾斜 45 4min 5min 倾斜可加速血小板的粘附聚集过程，并加大血小板释放的凝血因子与血细胞的接触面积，从而加快了凝血的过程。该过程是内源性凝血过程。 5 细玻璃粉少许（ 6滴生理盐水） 2min45s 3min 玻璃粉是异物，可激活凝血因子及血小板，启动凝血 过程。 6 脑组织浸出液（ 6滴） 15s 30s 脑组织液中有组织因子途径抑制物，是外源性凝血途径 的特异性抑制剂，因而能加速凝血过程 。 7 置于 40水浴（ 6滴生理盐水） 165s 165s 适当升高温度，能增加酶的活性，加快凝血过程。 8 置于 10水浴（ 6滴生理盐水） 大于20min 降低温度可以降低
8、酶的活性，延缓凝血过程。 9 竹签搅拌（ 6滴生理盐水） 有富有弹性的纤维蛋白纠缠在竹签上 同上 在竹签的搅动下，特别是缠上线的接触面粗糙的竹签，能加速凝血过程，使凝血因子按一定顺序相继激活而生成凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白，而纠结在竹签上，形成一层蛋白膜。 动物生理学实验报告 Page 3 机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机 体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。机体的正常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能，有效的血小板质量和数量，正常的血浆凝血因子活性。其中，血小板和凝血因子是生理性止凝血的重要成分 ,(见图 1)。抗凝系统不仅包括抗凝因子，还
9、包括纤溶系统。 BT 出血时间 CFT 束臂试验 CRT 血块收缩试验 BPC 血小板计数 CT 凝血时间 RT 复钙时间 APTT 活化部分凝血活酶时间 PT 凝血酶原时间 PF3血小板第 3 因子 TF 组织因子 Fb 纤维蛋白 TXA2血栓素 A2 5-HT5羟色胺 PK 激肽释放酶原 HMWK 高分子量激肽原 图 1 正常止血机制及血栓与止血常用筛选试验检测环节 血小板的作用： 在正常的血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损伤时，血小板的止血兼有机械性的堵 塞伤口和生物化学性粘附聚集作用。止血时，首先是受损的血管壁发
10、生收缩，使局部血液流动变慢或减少。血液中的血小板在 vWF 因子存在下迅速粘附于暴露的胶原纤维，此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集 (血小板膜糖蛋白 IIb/IIIa 由纤维蛋白原介导发生互相粘附、聚集 )，此为血小板第一相聚集，激活的血小板便发生释放反应和花生四烯酸代谢，其中许多物质，如血小板的 ADP 等，可加速血小板的聚集、变性成为不可逆的“第二相聚集”，形成白色血栓，构成了初期止血的屏障。与此同时，由 血小释放和激活许多促凝物质参与血液凝固反应。血小板膜磷脂表面提供了凝血反应的场所，血小板第 3因子在凝血过程多个环节中发挥重要作用
11、，血小板合成释放的 TXA2 和 5-HT 促使进一步收缩，血小板收缩蛋白则最终可使纤维蛋白收缩 (血块收缩 )，使血栓更为坚固，止血更加彻底。 凝血过程： 血液凝固简称凝血，是血液由流动状态变为凝胶状态的过程，它是止血功能的重要组成部分。凝血过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。迄今为止，参与凝血的因子共有 14个。其中用罗马数字编号的有 12 个 (从， 其中因子并不存在 )。习惯上，前 4个凝血因子常分别称为纤维动物生理学实验报告 Page 4 蛋白原 (因子 )、凝血酶 (因子 )、组织因子 (因子 )和钙离子 (因子 )。凝血因子 VI 已知是血
12、清中活化的凝血因子 V，故不再视为一独立的凝血因子 。 1内源性凝血途径 内源性凝血途径是指参加的凝血因子全部来自血液 (内源性 )。临床上常以活化部分凝血活酶时间 (APTT)来反映体内内源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子激活，到因子 X激活的过程。当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子即与之结合，在 HK 和 PK的参与下被活化为 a。在不依赖钙离子的条件下，因子 a将因子激活。在钙离子的存在下，活化的 a又激活了因子。单独的 a激活因子 X的效力相当低，它要与 a结合形成 1： 1的复合物，又称为因子 X酶复合物。这一反应还必须有 Ca2
13、+和 PL共同参与。 2外源性凝血途径 外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子被激活的过程。临床上以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状况。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜 蛋白。当组织损伤后，释放该因子，在钙离子的参与下，它与因子一起形成 1： 1 复合物。一般认为，单独的因子或组织因子均无促凝活性。但因子与组织因子结合会很快被活化的因子激活为 a，从而形成 a组织因子复合物，后者比 a单独激活因子增强 16000倍。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。外源性凝血途径主要受组织因子途径抑
14、制物 (TFPI)调节。 TFPI是存在于正常人血浆及血小板和血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过与因子 a 或因子 a-组织因子 -因子 a 结合形成复合物来抑制因子 a或因子 a-组织因子的活性。另外 ，研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。 3凝血的共同途径 从因子 X被激活至纤维蛋白形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。 (1) 凝血酶的生成：即因子 a、因子 a 在钙离子和磷脂膜的存在下组成凝血酶原复合物，即凝血活酶，将凝血酶原转变为凝血酶。 (2) 纤维蛋白形成：纤维蛋白原被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，并交联形成稳定的纤维蛋白凝块，这一
15、过程可分为三个阶段，纤维蛋白单体的生成，纤维蛋白单体的聚合，纤维蛋白的交联。纤维蛋白原含有三对多肽链，其中 纤维蛋白肽 A(FPA)和 B(FPB)带较多负电荷，凝血酶将带负电荷多的纤维蛋白肽 A和肽 B水解后除去，转变成纤维蛋白单体。从纤维蛋白分子中释放出的 FPA和 FPB可以反映凝血酶的活化程度，因此 FPA和 FPB的浓度测定也可用于临床高凝状态的预测。纤维蛋白单体生成后，即以非共价键结合，形成能溶于尿素或氯醋酸中的纤维蛋白多聚体，又称为可溶性纤维蛋白。纤维蛋白生成后，可促使凝血酶对因子的激活，在 a 与钙离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。纤维
16、蛋白与凝血酶有高亲和力，因此纤 维蛋白生成后即能吸附凝血酶，这样不仅有助于局部血凝块的形成，而且可以避免凝血酶向循环中扩散。 在凝血共同途径中有两步重要的正反馈反应，有效地放大了内外源凝血途径的作用。 一是 Xa 形成后，可反馈激活因子、； 二是凝血酶形成后，可反馈激活因子、以及凝血酶原。凝血酶还可促使血小板发生聚集和释放反应，刺激血小板收缩蛋白引起血块退缩。但大量凝血的产生却反过来破坏因子、和因子，这是正常凝血的负反馈调节，以防止不适当的过度凝血。 抗凝剂的选择： （ 1） 草酸钾：常用于尿素、肌酐、 纤维蛋白原等测定，不能用钾、钙等测定，对 LDH、丙酮酸激酶、 AKP 和淀粉酶有抑制作用
17、。 （ 2） 肝素：常用于电解质、血气分析、血氨等测定。抗凝剂比例为 50 61u肝素 /5ml血。注意钠盐可使淀粉酶升高。 （ 3） 氟化钠：常用氟化钠 草酸钠混合抗凝剂作血糖测定的抗凝剂，氟化钠可以抑止烯醇化酶，它可避免血细胞葡萄糖酵解酶的作用，延长标本的保存时间。 动物生理学实验报告 Page 5 （ 4） 二乙胺四乙酸钠盐（ EDTA-Na2）：生化常用的抗凝剂，但不能用于钙、钠、及含氮物质的测定，对淀粉酶、肌酸激酶、 AKP、 ALP、 5 -核苷酸酶等可抑制，对丙 酮酸激酶有明显升高的作用。 （ 5） 枸橼酸钠，测定血沉用 3.8%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂与血液比例为 1： 4，凝血试验需用 3.2%枸橼酸钠抗凝，比例为 1： 9。 （ 6） 实验室使用抗凝剂种类较多，血细胞分析及红细胞比积测定宜用 EDTA K2 抗凝，保证室温下 6小时 RBC体积不变，抗凝剂比例为 1.0 2.0mg/1ml血。 【参考文献】 生理学 姚泰 人民卫生出版社 动物生理学实验 魏香 清华大学出版社
