1、DB13/T 2595 2017 ICS 65.020 B 16 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2595 2017 葡萄霜霉病菌保存技术规程 2017 - 11 - 22 发布 2017 - 12 - 22 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2595 2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出 的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学 、辽宁省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：冉隆贤、申红妙、李正楠、贾招闪、甄志先、刘长远、杜兴 兰。 DB13/T 2595 2017 1 葡萄霜霉病菌保存技术规程 1 范围
2、本标准规定了葡萄霜霉病菌 Plasmopara viticola (Berk et Curtis) Berl. et de Toni离体保存技术的术语和 定义、 葡萄 霜 霉病菌保存概述和 葡萄霜霉病菌保存技术 等内容。 本标准适用于教育、研究机构、农药研发部门和药效测定单位等保存葡萄霜霉病菌。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 葡萄试管苗 In vitro Grape Plantlet 是指在试管等容器中 经过 组织培养获得的葡萄苗 。 2.2 水琼脂平板 Water Agar Plate 用 作 保湿的平板培养基。 6 g琼脂， 1000 mL蒸馏水，直径 9 cm的
3、培养皿每个约倒入 10 mL。 3 葡萄霜霉病菌保存概述 葡萄 霜霉病 菌只能在活体寄主上存活，在离体培养基上不能生长繁殖和保存，致使相关的研究受到限制。 要保持对该病 菌 持续的研究并排除其它杂菌的干扰， 需对葡萄 霜霉病 菌进行 保存， 且保持病菌的致病力，并 提高 其 存活率和稳定性 。本规程针对不同的用途，分别对葡萄霜霉病菌进行了超低温保存，主要用于病菌 的 长期保存；真空冷冻干燥保存，主要用于病菌复壮；葡萄试管苗叶片保存，主要用于病菌纯化，以保证病菌 生物学和遗传学等研究结果的准确性。 4 葡萄霜霉菌保存技术 4.1 超低温保存法 4.1.1 葡萄霜霉病样采集 在田间采集感染葡萄霜霉
4、病的新鲜发病叶片，装于保鲜袋中，并放置于 0 4 的保温盒中带回室内。 4.1.2 霜霉病样的预处理 用清水 冲 洗叶片， 用灭菌棉签轻刷叶片表面的霉层； 将蘸湿的脱脂棉球包住叶柄， 背面朝上置于垫有湿纱布的培养皿中 ； 培养皿用保鲜膜封口，置入光照培养箱中（ 20 、 12 h光照， 18 、 12 h黑暗，相对湿度 100 %）培养 2 d，待其重新长出干净的霜霉层，备用。 DB13/T 2595 2017 2 4.1.3 孢子囊悬浮液的 制备 用灭菌的棉签将 新长出霉层上的 孢子囊 刷至无菌水中 ，用单层擦镜纸过滤，去除孢囊梗，得到干净的 孢子囊 ； 用无菌水 调节 浓度为 106个 /
5、mL的孢子囊悬浮液 ， 备用。 4.1.4 孢子囊 的 保存 取 4.1.3中 获得 的孢子囊悬浮液 10 mL，加入等量的 10%的二甲基亚砜（ DMSO），配制成含 5%二甲基亚砜的孢子囊悬浮液 。 将配好的孢子囊悬浮液分装于规格为 2.0 mL的冻存管中，置于 -80的超低温冰箱中保存。 待需要霜霉病菌时，取出冻存管，室温融化后， 在 2000 rpm下离心 15 min， 弃上清，加入无菌水混匀并再次离心，用于 清洗孢子囊 ，去除 二甲基亚砜， 共离心 3次 。 用无菌水调节浓度后接种于干净健康的葡萄叶片背面繁殖使用。 4.1.5 保存时效 含 5 %二甲基亚砜的孢子囊悬浮液 -80超
6、低温可以保存至少 5年，孢子囊的致病力无明显降低。 4.2 真空冷冻干燥保存法 4.2.1 霜霉病叶冷冻 干燥 霜霉病样 采集 及预处理同 4.1.1和 4.1.2； 将 4.1.2中准备好的新鲜病叶 的 病斑部位剪成 2 cm2 cm大小，放入冷冻干燥 机 中，在温度为 -41、压力 为 13.0Pa下真空冷冻干燥 36 h，直至材料恒重 。 4.2.2 真空封装 将真空冷冻干燥后的病叶碎片取出，分装进 规格为 20 cm30 cm的 铝箔袋，并用真空封口机进行压缩封口处理，每袋 30片； 将分装的材料分别置于 4、 -20或 -80的冰箱中保存。 4.2.3 保存时效 4保存，孢子囊具有较
7、高致病力，最适保存 25 d 35 d； -20低温保存，对孢子囊致病力影响较小，最适保存 1年； -80超低温保存，更有利于孢子囊保持较高致病力，适合长期保存。 4.3 葡萄试管苗叶片 保存 法 4.3.1 培养基的配制 4.3.1.1 水琼脂的配制 称取 6 g琼脂粉加入蒸馏水中，并用玻璃棒搅拌，均匀加热使其完全溶解，定容至 1000 mL； 取 200 mL分装于 500 mL的三角瓶中，置于高压灭菌锅内 121下灭菌 20 min 30 min； 将灭菌后的三角瓶取出，室温放置 24 h，确定无杂菌生长后待用。 4.3.1.2 葡萄培养基的配制 以 1/2 MS+1 mg/L 6-BA
8、+ 0.1 mg/L IBA +30 g/L蔗糖 +6 g/L琼脂（ pH值为 5.8 6.0） 进行配制； DB13/T 2595 2017 3 将配制好的培养基倒入 100 mL三角瓶内，每瓶 40 mL，把分装培养基后的三角瓶置于高压灭菌锅内121下灭菌 20 min 30 min，待用。 4.3.2 葡萄枝条 预处理与消毒 取 未木质化或半木质化的 新鲜 葡萄枝条，去除叶片， 剪成 3 cm 4 cm长的带腋芽的 小段， 用流水冲洗 5 min； 在超净 工作台上 ，将洗净的茎段 用 70 %的酒精浸泡 30 s，再用 0.1%升汞 浸泡 5 min 10 min，最后用 无菌水清洗
9、4次 ； 将消毒后的茎段放在 无菌滤纸 的培养皿中，剪去茎段上下两端褐化的部分，形态学上端平剪，下端剪为马蹄形； 将 剪成 2 cm 2.5 cm的带腋芽 茎段接入 灭菌好的 培养基中 ，置于 培养室内 培养 （ 25 、 12 h光照，20 、 12 h黑暗） 。 4.3.3 葡萄试管苗 叶片 接种 待葡萄 试管苗 高度达到 5 cm以上，着生 3 5片叶 时，在超净 工作台上 ，用灭菌后的剪刀剪取 试管苗 叶片，将剪下的叶片背面朝上放置于倒好 的水琼脂平板上； 取 4.1.2中 重新长出干净霜霉层 的叶片， 用蘸有无菌水的挑针轻轻挑取干净的霜霉病菌，将其接种于 试管苗 叶片上； 接种后将平板密封，置于 光照培养箱内培养 7 d 10 d， 培养 条件同 4.1.2。 4.3.4 霜霉 菌 的 纯化 按照 4.3.3的方法取出 试管苗 叶片，背面朝上放置于水琼脂平板上，用蘸有无菌水的解剖针挑取已接种 试管苗 叶片上的霜状霉层接菌，培养条件同 4.1.2，以获得没有杂菌的葡萄霜霉病菌。 4.3.5 保存时效 在缺乏寄主的季节和地区，可利用葡萄 试管苗 叶片在室内对葡萄 霜霉病 菌进行连续培养和扩繁，4可以保存 30 d 35 d， 20可以保存 10 d 12 d。 _
