1、April 2017DEUTSCHE NORM Preisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30; 67.120.10!%bF“2639235www.din.deDIN 10106Alleinverkauf der Normen durch Beuth
2、 Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10106:1991-09www.beuth.deGesamtumfang 13 SeitenDDIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)Mikrobiologische Untersuchung von Fleisch und Fleischerzeugnissen Bestimmung von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium Spatelverfahre
3、n (Referenzverfahren) Microbiological analysis of meat and meat products Determination of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium Spatula method (reference method) Analyse microbiologique de la viande et des produits base de viande Dtermination des Enterococcus faecalis et Enterococcus faeciu
4、m Mthode avec spatule (mthode de rfrence) DIN 10106:2017-04 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich . 4 2 Normative Verweisungen . 4 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung . 4 5 Chemikalien und Nhrboden 5 5.1 Citrat-Azid-Tween-Carbonat-Agar nach Reuter (CATC-Agar) . 5 5.1.1 Grundnhrboden . 5 5.1.2 Nat
5、riumcarbonat-Lsung . 5 5.1.3 Triphenyltetrazoliumchlorid-Lsung (TTC-Lsung) . 6 5.1.4 Natriumazid-Lsung . 6 5.1.5 Vollstndiger Nhrboden . 6 5.1.6 Herstellen der Agarplatten 7 5.2 Verdnnungslsung 7 5.3 Wasserstoffperoxid-Lsung, 7 5.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien 7 6 Gerte . 8 7
6、Probenahme 8 8 Durchfhrung 9 8.1 Vorbereitung und Herstellung der Verdnnungen . 9 8.2 Beimpfung 9 8.3 Bebrtung . 9 9 Auswertung 9 9.1 Zhlen der Kolonien . 9 9.2 Besttigung 9 9.3 Berechnung der Keimzahl 10 9.4 Schtzung der Keimzahl 11 10 Untersuchungsbericht . 12 Literaturhinweise . 13 DIN 10106:2017
7、-04 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 057-01-06 AA Mikrobiologie der Lebensmittelkette“ im DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. DI
8、N ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Dieses Dokument ersetzt DIN 10106:1991-09. nderungen Gegenber DIN 10106:1991-09 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) im Abschnitt 2 Normative Verweisungen“ wurden die aktuellen Normen aufgenommen; b
9、) es wurde ein neuer Unterabschnitt 5.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien“ aufgenommen; c) die Literaturhinweise wurden aktualisiert; d) technische und redaktionelle berarbeitung sowie Ergnzungen zwecks Anpassung an die derzeit gltigen Gestaltungsregeln. Frhere Ausgaben DIN 10106:
10、1991-09 DIN 10106:2017-04 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Referenzverfahren zur Bestimmung der Anzahl von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium fest. Das Verfahren ist anwendbar bei Fleisch und Fleischerzeugnissen sowie Erzeugnissen mit einem Zusatz von Fleisch und Fleischerzeugni
11、ssen. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des i
12、n Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 6887-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 1: Allgemeine Regeln fr die H
13、erstellung von Erstverdnnungen und Dezimalverdnnungen DIN EN ISO 6887-2, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 2: Spezifische Regeln fr die Vorberei
14、tung von Fleisch und Fleischerzeugnissen DIN EN ISO 11133, Mikrobiologie von Lebensmitteln, Futtermitteln und Wasser Vorbereitung, Herstellung, Lagerung und Leistungsprfung von Nhrmedien 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3.1 Enterococcus faecalis Enterococcu
15、s faecium grampositive Kokken, die nach dem in dieser Norm festgelegten Verfahren auf dem CATC-Nhrboden krftig oder weniger krftig rote Kolonien bilden und im Katalase-Test negativ reagieren Anmerkung 1 zum Begriff: Die krftige oder weniger krftige rote Frbung der Kolonien entsteht durch die ganze o
16、der teilweise Reduktion von Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Anmerkung 2 zum Begriff: Der CATC-Nhrboden ist voll inhibitiv gegenber Stmmen, die nicht zu den Streptokokken gehren, zudem weitgehend selektiv fr Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium. Andere Streptokokken mit schwacher oder oh
17、ne TTC-Reduktion knnen in niedrigen Anwachsraten zur Entwicklung kommen. Diese sind koloniemorphologisch gut von den Enterokokken abgrenzbar, siehe Literaturhinweis 3. 4 Kurzbeschreibung Agarplatten mit dem selektiven Nhrboden werden mit Teilmengen von jeweils 0,1 ml der unverdnnten homogenisierten
18、Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Verdnnungen jeweils im Doppelansatz beimpft. Bei einer Temperatur von 37 C wird unter aeroben Bedingungen 24 h bebrtet und anschlieend 24 h bei Raumtemperatur nachinkubiert. Aus dem Anteil der auf dem Nhrboden ganz oder teilweise rot gewachsenen Kolonien
19、 wird die Anzahl von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium je g oder ml der Probe berechnet. DIN 10106:2017-04 5 5 Chemikalien und Nhrboden Die Nhrbodenbestandteile und Chemikalien mssen fr mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, sind eindeutig deklar
20、ierte Nhrbodenbestandteile und analysenreine Chemikalien oder Trockennhrbden zu verwenden. Den Anweisungen des Herstellers ist strikt zu folgen. Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgerten destilliert oder entmineralisiert und mindestens von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestandt
21、eile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen. 5.1 Citrat-Azid-Tween-Carbonat-Agar nach Reuter (CATC-Agar) 5.1.1 Grundnhrboden 5.1.1.1 Zusammensetzung Pepton aus Casein, tryptisch verdaut 15,0 g Hefeextrakt, Pulver 5,0 g Natriumcitrat, C6H5Na3O7 2H2O 15,0 g Kaliumdihydrogenphosph
22、at, KH2PO45,0 g Tween 801)(Polyoxyethylensorbitanmonooleat) 1,0 g Agar 12,0 g bis 15,0 gaWasser 1 000 ml aIn Abhngigkeit von der Gelierfhigkeit des Agars. 5.1.1.2 Herstellung Die Nhrbodenbestandteile werden in Wasser gelst. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterilisieren bei 7,0 0,1
23、liegt, gemessen bei einer Temperatur von etwa 45 C. Der Nhrboden wird 15 min bei 121 C sterilisiert. Vor dem Zusatz der Selektivstoffe wird der Grundnhrboden auf 50 C abgekhlt. 5.1.2 Natriumcarbonat-Lsung 5.1.2.1 Zusammensetzung Natriumcarbonat, Na2CO3, wasserfrei 10,0 g Wasser 100 ml 1) Tween ist e
24、in Warenzeichen der ICI-America Inc. Auskunft ber Bezugsquellen erteilt der DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN, Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu den gleichen Ergebnissen fhren. DIN 1010
25、6:2017-04 6 5.1.2.2 Herstellung Das Natriumcarbonat wird, erforderlichenfalls bei leichter Erwrmung bis 50 C, im Wasser gelst. Die Lsung wird anschlieend durch Filtration sterilisiert. Sie ist bei Bedarf frisch herzustellen. 5.1.3 Triphenyltetrazoliumchlorid-Lsung (TTC-Lsung) 5.1.3.1 Zusammensetzung
26、 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid 1,0 g Wasser 100 ml 5.1.3.2 Herstellung Das 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid wird im Wasser gelst. Die Lsung wird anschlieend durch Filtration sterilisiert. Die Lsung ist bei einer Temperatur zwischen 0 C und 5 C im Dunkeln nicht lnger als 48 h aufzubewahren. 5.1.
27、4 Natriumazid-Lsung 5.1.4.1 Zusammensetzung Natriumazid, NaN310,0 g Wasser 100 ml 5.1.4.2 Herstellung Das Natriumazid wird im Wasser gelst. Die Lsung wird anschlieend durch Filtration sterilisiert. Wenn sie nicht unmittelbar nach der Herstellung verwendet wird, ist die Lsung im Dunkeln bei einer Tem
28、peratur zwischen 0 C und 5 C nicht lnger als einen Monat aufzubewahren, wenn sichergestellt ist, dass keine Vernderungen eintreten knnen. 5.1.5 Vollstndiger Nhrboden 5.1.5.1 Zusammensetzung Grundnhrboden, nach 5.1.1 1 000 ml Natriumcarbonat-Lsung, nach 5.1.2 20 ml TTC-Lsung, nach 5.1.3 10 ml Natrium
29、azid-Lsung, nach 5.1.4 4 ml 5.1.5.2 Herstellung Dem nach 5.1.1.2 hergestellten und auf 50 C abgekhlten Grundnhrboden werden die vorher auf 50 C temperierten anderen Bestandteile einzeln unter stndigem Rhren zugegeben. DIN 10106:2017-04 7 5.1.6 Herstellen der Agarplatten Teilmengen von etwa 15 ml des
30、 vollstndigen Nhrbodens werden in Petrischalen bergefhrt und zum Verfestigen stehengelassen. Wenn die Agarplatten nicht unmittelbar nach der Herstellung verwendet werden, sind sie bei einer Temperatur zwischen 2 C und 8 C nicht lnger als 2 Wochen aufzubewahren. Unmittelbar vor der Verwendung werden
31、die Platten mit der Agaroberflche nach unten, schrg auf dem abgenommenen Deckel liegend, in einem Brutschrank etwa 30 min bei vorzugsweise 50 C (6.1) getrocknet. 5.2 Verdnnungslsung Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. 5.3 Wasserstoffperoxid-Lsung, w 3 % Massenanteil Die Lsung ist im Dunkel
32、n bei einer Temperatur zwischen 0 C und 5 C nicht lnger als einen Monat aufzubewahren. 5.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien Zur Definition der Produktivitt und Selektivitt siehe DIN EN ISO 11133. In den Tabellen 1 und 2 sind die Leistungsprfungen fr den Citrat-Azid-Tween-Carbonat-
33、Agar nach Reuter (CATC-Agar) und die Verdnnungsflssigkeiten aufgefhrt. Tabelle 1 Leistungsprfung von CATC-Agar Funktion Bebrtung KontrollstmmeaReferenz-Medium Prfver-fahren Kriterien Charakteristische Reaktionen Produkti-vitt (24 2) h/ Enterococus faecalisb WDCM 00009 oder WDCM 00087 TSAcQuantitativ
34、 Produkti-vitts-verhltnis (PR) 0,5 Rote, glatte erhabene Kolonien (37 1) C, anschlieend (24 2) h/ Raum-temperatur Enterococcus faecium WDCM 00177 Rosa bis rote, raue, flache Kolonien mit hellem Rand Selektivitt Escherichia coli WDCM 00012 oder WDCM 00013 - Qualitativ Vollstndige Hemmung (0) - aBezug
35、nehmend auf den Referenzstamm-Katalog, der (geprft am 29.09.2016) unter http:/www.wfcc.info bezglich der Kultur-Stammsammlungsnummer und der Kontaktdetails eingesehen werden kann; WDCM: World Data Centre for Microorganisms. bDurch das Laboratorium des Anwenders zu verwendende Spezies (als Minimum).
36、cTrypton-Soja-Agar. DIN 10106:2017-04 8 Tabelle 2 Leistungsprfung der Verdnnungsflssigkeiten Medium Bebrtung KontrollstmmeaReferenz-Medium Prf-verfahren Kriterien Peptonsalz-Lsung 45 min bis 1 h/20 C bis 25 C Escherichia colibWDCM 00012 oder WDCM 00013TSAcQuantitativ 50 % Kolonien/T0( 50 % der Ausga
37、ngskeimzahl) Staphylococcus aureus WDCM 00034 Gepuffertes Peptonwasser 45 min bis 1 h/20 C bis 25 C Escherichia colibWDCM 00012 oder WDCM 00013 Staphylococcus aureus WDCM 00034TSAcQualitativ 50 % Kolonien/T0 ( 50 % der Ausgangskeimzahl) aBezugnehmend auf den Referenzstamm-Katalog, der (geprft am 29.
38、09.2016) unter http:/www.wfcc.info bezglich der Kultur-Stammsammlungsnummer und der Kontaktdetails eingesehen werden kann; WDCM: World Data Centre for Microorganisms. bDurch das Laboratorium des Anwenders zu verwendende Spezies (als Minimum). cTrypton-Soja-Agar. 6 Gerte Alle Glasgerte mssen vor der
39、Verwendung sorgfltig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgerte mssen steril sein. Zustzlich zu den in DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2 aufgefhrten Gerten werden die Gerte nach 6.1 bis 6.8 bentigt. Mechanische Pipetten und andere Gerte fr die mechanisierte und automatisierte Durchfhru
40、ng der Arbeitsvorgnge drfen verwendet werden, sofern durch entsprechende Untersuchungen sichergestellt ist, das vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. 6.1 Brutschrank, einstellbar auf 50 C. 6.2 Brutschrank, einstellbar auf (37 1) C, z. B. Brutschrank siehe Literaturhinweis 1. 6.3 Wasserbder, zum E
41、rhitzen und Khlen der Lsungen und Nhrbden auf geeignete Temperaturen. 6.4 Kulturrhrchen, Lnge etwa 160 mm, Durchmesser etwa 16 mm. 6.5 Petrischalen, Durchmesser etwa 9 cm, z. B. Petrischalen siehe Literaturhinweis 2. 6.6 Spatel, Durchmesser etwa 3,5 mm, Ausstrichbreite 30 mm. Die Schnittkanten an de
42、n Enden mssen geglttet sein. 6.7 Objekttrger. 6.8 Glasstbchen. 7 Probenahme Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. DIN 10106:2017-04 9 8 Durchfhrung 8.1 Vorbereitung und Herstellung der Verdnnungen Die Vorbereitung der Verdnnungsrhrchen und der Probe, sowie die Herstellung der Erstverdnnung u
43、nd weiterer Dezimalverdnnungen erfolgt nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. Die Zeitspanne von Beginn der Herstellung der Erstverdnnung bis zur Beimpfung des Nhrbodens nach 8.2 darf 30 min nicht berschreiten. 8.2 Beimpfung 8.2.1 Die Verdnnungsreihe wird im Doppelansatz untersucht. Mit einer
44、 Pipette werden jeweils 0,1 ml der unverdnnten homogenisierten Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Verdnnungen auf je zwei Agarplatten gegeben. Dabei ist mit der hchsten Verdnnung zu beginnen. Bevor die Teilmengen auf die Platten bergefhrt werden, ist die Pipette dreimal zu fllen und zu le
45、eren. Die Teilmengen werden mit Spateln so schnell wie mglich auf der Oberflche der Agarplatten in kreisender Bewegung gleichmig verteilt. 8.2.2 Sofern geringe Enterokokken-Anzahlen erfasst werden sollen, wird 1 ml einer unverdnnten homogenisierten Probe auf der Oberflche von 3 bis 4 Agarplatten gle
46、ichmig verteilt und mit einem Spatel ausgestrichen. Ein Doppelansatz ist erforderlich. 8.3 Bebrtung Die nach 8.2 beimpften Platten werden mit dem Boden nach oben 24 h im Brutschrank (6.2) bei einer Temperatur von 37 C bebrtet, anschlieend 24 h bei Raumtemperatur nachinkubiert. 9 Auswertung 9.1 Zhlen
47、 der Kolonien 9.1.1 Nach der Bebrtung (8.3) werden die charakteristischen Kolonien wie folgt markiert und gezhlt: a) rote, glatte erhabene Kolonien Enterococcus faecalis und ssp.; b) rosa bis rote, raue, flache Kolonien mit hellem Rand Enterococcus faecium. Rosa bis weiliche kleine Kolonien (Durchme
48、sser 0,5 mm) werden nicht mitgezhlt. 9.1.2 Beim Zhlen werden nur solche Platten bercksichtigt, die zwischen 1 und 150 typische Kolonien der Species E. faecium und E. faecalis enthalten. Liegen gut abgesetzte Einzelkolonien vor, knnen auch Platten mit bis zu 300 Kolonien herangezogen werden. 9.1.3 Wenn weniger als 15 Kolonien auf den Platten mit einer unverdnnten homogenisierten Probe oder mit der niedrigsten Verdnnung (Erstverdnnung) vorhanden sind, werden diese Platten zur Schtzung der Enterokokken-Anzahl herangezogen (siehe 9.4). 9.1.4 Die nach 8.2.2 beimpfte
