1、September 2013DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.10
2、!%Lp“2044177www.din.deDDIN 10484Milch Bestimmung des Gehaltes an Harnstoff und Ammoniak Photometrisches VerfahrenMilk Determination of urea and ammonia content Photometric methodLait Dtermination de la teneur en ure et en ammoniac Mthode photomtriqueAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH,
3、10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 13 SeitenDIN 10484:2013-09 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen 4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Reagenzien .4 5 Prfeinrichtung 5 6 Probenahme .6 7 Durchfhrung .6 8 Berechnung 7 9 Przision des Verfahrens . 10 10 Untersuchungsbericht
4、. 10 Anhang A (informativ) Przisionsdaten . 11 Literaturhinweise . 13 DIN 10484:2013-09 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN, Arbeitsausschuss NA 057-05-13 AA Milch und Milcherzeugnisse Probenahme- und Untersuchungs-verfahren“, auf
5、 der Basis der AFNOR-Norm NF V 04-217:1992-12 1 erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. DIN 10484:2013-09 4 1 Anwendung
6、sbereich Diese Norm legt ein photometrisches Verfahren zur Ermittlung des Gehaltes an Harnstoff und Ammoniak in Milch fest. Da die Ermittlung des Gehaltes an Harnstoff ber die Bildung von Ammoniak verluft, ist es erforderlich, den bereits in der Probe vorhandenen Gehalt an Ammoniak mitzubestimmen un
7、d zu bercksichtigen. Die Norm stellt ein alternatives Messverfahren zu DIN EN ISO 14637 dar. Das Verfahren gilt fr Rohmilch, Konsummilch und rekonstituierte Milch. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung
8、 dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milcherzeugnisse Leitfaden zur Probenahme 3 Kurzbeschr
9、eibung Die Milch wird verdnnt und zur Entfernung der strenden Proteine und Fette vorbehandelt. Der Harnstoff (CH4N2O) wird in Gegenwart des Enzyms Urease zu Ammoniak (NH3) und Kohlendioxid (CO2) gespalten. 23Urease224CONH 2OHONCH + + Der gebildete bzw. vorhandene Ammoniak setzt in Gegenwart des Enzy
10、ms Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) und reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) 2-Oxoglutarat zu L-Glutamat um. OHNADGlutamatLNHNADH tOxoglutara22GLDH4+ +Die whrend der Reaktion verbrauchte Menge an NADH ist der Ammoniak-Menge bzw. der halben Harnstoff-Menge quivalent. Die Messgre ist dabei das
11、 NADH, das aufgrund seiner Extinktion bei 340 nm spektralphotometrisch bestimmbar ist. 4 Reagenzien Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss bidestilliert oder mindestens von gleicher Reinheit sein. 4.1 Essigsure-Lsung, Massenkonzentration (CH3COOH) = 100 g/l. 100,0
12、 g konzentrierte Essigsure werden in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst und bis zur 1 000-ml-Marke mit Wasser aufgefllt. 4.2 Natriumacetat-Lsung, Stoffmengenkonzentration c(Na(CH3COO) 3 H2O) = 1 mol/l. 136,0 g Natriumacetat-Trihydrat werden in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst und bis
13、 zur 1 000-ml-Marke mit Wasser aufgefllt. 4.3 Natriumhydroxid-Lsung, c(NaOH) = 0,1 mol/l. 4,0 g Natriumhydroxid werden in einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst und bis zur 1 000-ml-Marke mit Wasser aufgefllt. DIN 10484:2013-09 5 4.4 Natriumhydroxid-Lsung, c(NaOH) = 5 mol/l 200,0 g Natriumhydroxi
14、d werden in einem 1000-ml-Messkolben in Wasser gelst und bis zur 1 000-ml-Marke mit Wasser aufgefllt. 4.5 Pufferlsung, pH = 8,0 9,30 g Triethanolaminchlorhydrat (C6H15NO3 HCl) und 0,220 g 2-Oxo-dinatriumglutamat-dihydrat (C5H4Na2 2 H2O) werden zusammen in einem 100-ml-Messkolben in 70 ml Wasser gels
15、t und der pH-Wert wird mit den Natriumhydroxid-Lsungen (c(NaOH) = 5 mol/l (4.4) und (c(NaOH = 0,1 mol/l) (4.3) bei 20 C auf pH = 8,0 0,1 eingestellt. Anschlieend wird bis zur 100-ml-Marke mit Wasser aufgefllt. Die Pufferlsung ist bei 0 C bis 5 C einen Monat haltbar. 4.6 Nicotinamidadenindinucleotid-
16、Lsung (NADH) 0,030 g Dinatrium-NADH (NADHNa2) und 0,060 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) werden in 6 ml Wasser gelst. Die Lsung ist bei 0 C bis 5 C einen Monat haltbar. 4.7 Glutamatdehydrogenase-Lsung (GLDH) Die GLDH-Lsung wird aus boviner Leber-GLDH und Glycerol-Lsung (Volumenanteil (C3H8O3) = 50
17、 %) bei pH = 7,0 so hergestellt, dass die Massenkonzentration an GLDH = 10 mg/ml betrgt und eine Mindestaktivitt des Enzyms von 1 000 U/ml1)erreicht wird. Die Lsung ist bei 0 C bis 5 C ein Jahr haltbar. 4.8 Urease-Lsung 10,0 mg trockenes Urease-Lyophilisat (entspricht 2,5 mg reinem Enzym) werden in
18、1 ml Glycerol-Lsung (C3H8O3) = 50 %) gelst. Die spezifische Ureaseaktivitt muss in der Glycerol-Lsung mindestens 250 U/ml betragen. Die Lsung ist bei 0 C bis 5 C vier Wochen haltbar. 4.9 Harnstoff- und Ammoniak-Standardlsung 2,500 g Harnstoff (CH4N2O) und 0,500 g Ammoniumsulfat (NH4)2SO4) werden in
19、einem 1 000-ml-Messkolben in Wasser gelst und bis zur 1 000-ml-Marke mit Wasser aufgefllt. Die Einwaage an Ammoniumsulfat entspricht hierbei 0,128 9 g Ammoniak. Die Standardlsung ist vor dem Gebrauch frisch anzusetzen. Gegebenenfalls kann die Lsung portionsweise eingefroren werden. ANMERKUNG Es befi
20、nden sich Fertigreagenzien im Handel, bei deren Verwendung die Arbeitsvorschriften des Prparateherstellers zu bercksichtigen sind. 5 Prfeinrichtung bliche Laborgerte sowie die Prfeinrichtungen nach 5.1 bis 5.11. 5.1 Analysenwaage, Skalenteilung 0,1 mg. 5.2 Messkolben, mit Nennvolumina von 100 ml und
21、 1 000 ml. 5.3 Messpipetten, mit Nennvolumina von 3,0 ml, z. B. nach DIN EN ISO 8655-2. 5.4 Messpipetten, zur enzymatischen Analyse geeignet, mit Nennvolumina von 0,02 ml, 1,0 ml und 2,0 ml, z. B. nach DIN EN ISO 8655-2. 5.5 Glastrichter. 1) 1 U (1 Unit) ist die Enzymmenge, die bei einer Temperatur
22、von 25 C unter definierten Bedingungen eine Substrat-menge von 1 mol Substrat je min umsetzt. DIN 10484:2013-09 6 5.6 Filterpapier, mittlere Filtrationsgeschwindigkeit. 5.7 Magnetrhrergert oder anderer geeigneter Rhrer. 5.8 Wasserbad, einstellbar auf 38 C 1 C. 5.9 pH-Messeinrichtung, bestehend aus p
23、H-Messgert, geeignet zur Messung auf 0,01 pH-Einheiten; sowie Glas- und Bezugselektrode, geeignet zur Messung bei 20 C. ANMERKUNG Glas- und Bezugselektrode knnen auch als Kombinationselektrode (Einstabmesskette) zusammen-gefasst sein. 5.10 Spektralphotometer, geeignet zur Messung bei 340 nm. 5.11 Me
24、sskvetten, aus Glas oder Kunststoff, Schichtdicke 1 cm, geeignet fr ein Messvolumen von 3,14 ml. 6 Probenahme Nach DIN EN ISO 707. 7 Durchfhrung 7.1 Kontrolle der Reagenzien Die Reagenzienlsungen (4.5 bis 4.8) mssen vor der Bestimmung, nachdem sie frisch angesetzt wurden, berprft werden. Dies gilt a
25、uch, wenn diese Reagenzienlsungen fr lngere Zeit nicht verwendet wurden. Hierzu wird 1 ml der Standardlsung (4.9) in einen 100-ml-Messkolben pipettiert und mit Wasser bis zur 100-ml-Marke aufgefllt. Zur Bestimmung des Harnstoff- und Ammoniakgehaltes wird nach 7.3 und 7.5 weiter verfahren und die Wie
26、derfindung ermittelt, wobei die Einwaage nach 7.3 10 g 0,01 g betragen muss. Die Wiederfindung muss 100 % 2 % betragen. 7.2 Vorbereitung der Probe Die Milchprobe wird bei 38 C 1 C im Wasserbad (5.8) temperiert, vorsichtig durchmischt und vor dem Einwiegen auf 20 C abgekhlt. 7.3 Herstellung der Probe
27、nlsung 10 g der nach 7.2 vorbereiteten Probe werden in einem 100-ml-Messkolben auf 0,01 g eingewogen und mit 20 ml Wasser, das eine Temperatur von 40 C besitzt, versetzt. Anschlieend wird 1 ml der Essigsure-Lsung (4.1) hinzupipettiert, die Lsung gut durchmischt und 5 min stehen gelassen. Danach wird
28、 der Lsung 1 ml der Natriumacetat-Lsung (4.2) zupipettiert, nochmals gut gemischt und 5 min stehen gelassen. Anschlieend werden der Lsung 2,5 ml der Natriumhydroxid-Lsung (4.3) zugefgt, gut gemischt und wiederum 5 min stehen gelassen. Die Lsung wird auf 20 C abgekhlt und anschlieend bis zur 100-ml-M
29、arke mit Wasser aufgefllt, durchmischt und 30 min stehen gelassen. Nach Beendigung der Fett und Proteinfllung wird die Niederschlagslsung ber einen Faltenfilter filtriert und das gewonnene klare Filtrat als Probenlsung eingesetzt. Es drfen auch andere Fllungsverfahren zur Herstellung der Probenlsung
30、 eingesetzt werden, wenn sie zu vergleichbaren Ergebnissen fhren. 7.4 Leerwert-Bestimmung Bei der Untersuchung der nach 7.3 hergestellten Probenlsung ist grundstzlich ein Leerwert mitzufhren, wobei anstelle der Milchprobe Wasser verwendet wird. DIN 10484:2013-09 7 7.5 Bestimmung Die Bestimmung (sieh
31、e Tabelle 1) wird bei Raumtemperatur von etwa 20 C durchgefhrt. Tabelle 1 Bestimmungsansatz fr die Gehalte an Harnstoff und Ammoniak in den Leerwert-, Standard- und Probenlsungen Kvette Leerwert Standard Probe Reagenzien Harnstoff + Ammoniak Ammoniak Harnstoff + Ammoniak Ammoniak Harnstoff + Ammonia
32、k Ammoniak Leerwertlsung nach 7.4 (ml) 0,200 1,000 - - - - Standardlsung nach 7.1 (ml) - - 0,200 1,000 - - Probenlsung nach 7.3 (ml) - - - - 0,200 1,000 Pufferlsung nach 4.5 (ml) 2,000 2,000 2,000 2,000 2,000 2,000 NADH-Lsung nach 4.6 (ml) 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 Urease-Lsung nach 4.8 (m
33、l) 0,020 - 0,020 - 0,020 - Wasser (ml) 0,800 0,020 0,800 0,020 0,800 0,020 Anschlieend mischenaund nach etwa 5 min die Extinktionen der Lsungen bei 340 nm gegen Luft messen (E1), Reaktion starten durch Zugabe von GLDH-Lsung nach 4.7 (ml) 0,020 0,020 0,020 0,020 0,020 0,020 Anschlieend mischenaund na
34、ch Stillstand der Reaktion (etwa 25 min bis 30 min) die Extinktionen bei 340 nm gegen Luft messen (E2) az. B. durch Umrhren mit Rhrspatel oder Umschwenken nach Verschlieen 8 Berechnung 8.1 Allgemeines Bei den jeweiligen Bestimmungsanstzen werden zunchst die Extinktionsdifferenzen (E1- E2) der Proben
35、 berechnet, dann werden von diesen Differenzen die Extinktionsdifferenzen der Leerwertproben abgezogen. Zur Erzielung eines ausreichend przisen Ergebnisses sollten die gemessenen Extinktionsdifferenzen nicht grer als 0,500 sein. Da anderenfalls die Konzentrationen an Harnstoff und Ammoniak zu hoch s
36、ind, muss eine Wiederholung der Bestimmung nach 7.5 mit einer entsprechenden Verdnnung des Filtrates durchgefhrt werden. 8.2 Berechnung der Extinktionen 8.2.1 Berechnung der Extinktionswerte der Standardlsung Aus den gemessenen Werten des Bestimmungsansatzes Harnstoff und Ammoniak wird nach Gleichun
37、g (1) die Summe der Extinktionen von Harnstoff und Ammoniak (EHA) ermittelt. Aus dem Bestimmungsansatz Ammoniak ergibt sich nach Gleichung (2) der Extinktionswert fr Ammoniak (EA). Der Extinktionswert fr Harnstoff (EH) errechnet sich nach Gleichung (3). DIN 10484:2013-09 8 EHA= (E1St- E2St) - (E1Lw-
38、 E2Lw) (1) EA= (E1St- E2St) - (E1Lw- E2Lw) (2) 5EEEAHAH= (3) Dabei ist E1Stdie Extinktion der Standardlsung nach 7.5 vor Zugabe der GLDH-Lsung (4.7); E2Stdie Extinktion der Standardlsung nach 7.5 nach Zugabe der GLDH-Lsung (4.7); E1Lwdie Extinktion des Leerwertlsung nach 7.5 vor Zugabe der GLDH-Lsun
39、g (4.7); E2Lwdie Extinktion der Leerwertlsung nach 7.5 nach Zugabe der GLDH-Lsung (4.7); 5 der Faktor fr das fnffach hhere Pipettiervolumen der Ammoniak-Standardlsung. 8.2.2 Berechnung der Wiederfindung der Standardlsung Die Wiederfindung der Harnstoff-Standardlsung, angegeben in Prozent, wird nach
40、Gleichung (4) berechnet; die Wiederfindung der Ammoniak-Standardlsung, angegeben in Prozent, wird nach Gleichung (5) berechnet. Wiederfindung Harnstoff g/l 2,5002100g/molE 06,6021HVdV= (4) Wiederfindung Ammoniak g/l 90,128100g/molE 03,1721AVdV= (5) Dabei ist 60,06 die relative molare Masse von Harns
41、toff, in Gramm je Mol; 17,03 die relative molare Masse von Ammoniak, in Gramm je Mol; EHdie berechnete Extinktion fr Harnstoff nach 8.2.1; EAdie berechnete Extinktion fr Ammoniak nach 8.2.1; 2 der stchiometrische Faktor bei der Harnstoffbestimmung (siehe 3); 2,500 die Massenkonzentration der Harnsto
42、ff-Standardlsung (4.9), in Gramm je Liter; 0,128 9 die Massenkonzentration der Ammoniak-Standardlsung (4.9), in Gramm je Liter; V1das Gesamtvolumen in der Messkvette, in Milliliter (3,14 ml); V2das Volumen der Standardlsung, in Milliliter (0,200 ml bzw. 1,000 ml); der Extinktionskoeffizient von NADH
43、 bei 340 nm, = 6,3 l mmol-1 cm-1; d die Schichtdicke der Messkvette, in Zentimeter (1 cm). DIN 10484:2013-09 9 8.2.3 Berechnung der Extinktionswerte der Probenlsung Die Berechnung der Extinktionswerte erfolgt in Anlehnung an 8.2.1. Aus den gemessenen Werten des Bestimmungsansatzes Harnstoff und Ammo
44、niak wird nach Gleichung (6) die Summe der Extinktionen von Harnstoff und Ammoniak (EHA) ermittelt. Aus dem Bestimmungsansatz Ammoniak ergibt sich nach Gleichung (7) der Extinktionswert fr Ammoniak (EA). Der Extinktionswert fr Harnstoff (EH) errechnet sich nach Gleichung (8). EHA= (E1Pr- E2Pr) - (E1
45、Lw- E2Lw) (6) EA= (E1Pr- E2Pr) - (E1Lw- E2Lw) (7) 5EEEAHAH= (8) Dabei ist E1Prdie Extinktion der Probenlsung nach 7.5 vor Zugabe der GLDH-Lsung (4.7); E2Prdie Extinktion der Probenlsung nach 7.5 nach Zugabe der GLDH-Lsung (4.7); E1Lwdie Extinktion des Leerwertlsung nach 7.5 vor Zugabe der GLDH-Lsung
46、 (4.7); E2Lwdie Extinktion der Leerwertlsung nach 7.5 nach Zugabe der GLDH-Lsung (4.7); 5 der Faktor fr das fnffach hhere Pipettiervolumen der Probenlsung. 8.2.4 Berechnung der Gehalte an Harnstoff und Ammoniak in der Probe Die Gehalte an Harnstoff, wH, und Ammoniak, wA, angegeben als Massenanteil i
47、n mg/kg Milch, errechnen sich nach Gleichung (9) und Gleichung (10). 231HH2Eg/mol 06,60VmdFVVw=(9) 231AAg/molE 03,17VmdFVVw= (10) Dabei ist wHder Harnstoffgehalt der Probenlsung, angegeben als Massenanteil in Milligramm je Kilogramm Milch; wAder Ammoniakgehalt der Probenlsung, angegeben als Massenan
48、teil in Milligramm je Kilogramm Milch; 60,06 die relative molare Masse von Harnstoff, in Gramm je Mol; 17,03 die relative molare Masse von Ammoniak, in Gramm je Mol; EHdie berechnete Extinktion fr den Harnstoff nach 8.2.3; EAdie berechnete Extinktion fr den Ammoniak nach 8.2.3; 2 der stchiometrische Faktor bei der Harnstoffbestimmung (siehe 3); DIN 10484:2013-09 10 V1das Gesamtvolumen in der Messkvette, in Milliliter (3,14 ml); V2 das zur Messung eingesetzte Volumen des Filtrates der Probenlsung, in Milliliter (0,200 ml bzw. 1,000 ml); V3das Volumen der Probenlsung nach 7.3
