1、Oktober 2007DEUTSCHE NORM Normenausschuss Medizin (NAMed) im DINPreisgruppe 16DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 11.100.30!,yd7“9866520www.din.deDDIN 58932-5Hmat
2、ologie Bestimmung der Blutkrperchenkonzentration im Blut Teil 5: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration derThrombozyten; Text Deutsch und EnglischHaematology Determination of the concentration of blood corpuscles in blood Part 5: Reference method for the determination of the concentratio
3、n of thrombocytes; Textin German and EnglishHmatologie Dtermination de la concentration des globules dans le sang Partie 5: Procdure de rfrence pour la dtermination de la concentration desplaquettes; Texte en allemand et anglaisAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth
4、.deGesamtumfang 37 SeitenDIN 58932-5:2007-10 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Begriffe .4 4 Formelzeichen5 5 Messgre und Einheit .7 6 Referenzverfahren .7 6.1 Anforderungen an das Thrombozytenzhlgert.7 6.2 Auswahl und Anwendung der Reagenzien zur immunologi
5、schen Markierung der Thrombozyten 9 6.3 Vorbereitung der Referenzmessung. 10 6.4 Durchfhrung der Referenzmessung . 12 6.5 Auswertung . 13 6.6 Messunsicherheit 15 6.7 Qualittskontrolle des Referenzverfahrens . 15 7 Ausgewhlte Verfahren 15 Anhang A (informativ) Erluterungen 16 A.1 Durchflusszytometris
6、ches Messverfahren. 16 A.2 Ableitung der Gleichung der Regressionsgeraden. 16 Anhang B (informativ) Abkrzungen 18 B.1 In der Durchflusszytometrie verwendete Abkrzungen . 18 Literaturhinweise . 19 DIN 58932-5:2007-10 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 063-03-06 AA Hmatologie“ des Norm
7、enausschusses Medizin (NAMed) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. erarbeitet und im Einvernehmen mit der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt Braunschweig und Berlin herausgegeben. Der Arbeitsausschuss setzt sich zusammen aus Vertretern der medizinischen Fachgesellschaften INSTAND, DGKL, DG
8、HO, DGZ und Vertretern der Diagnostikindustrie. DIN 58932, Hmatologie Bestimmung der Blutkrperchenkonzentration im Blut besteht aus: Teil 1: Blutentnahme, Probenvorbereitung, Einflussgren, Strfaktoren Teil 2: Kennzeichnende Gren fr Erythrozyten (Erythrozytenindices) Teil 3: Bestimmung der Konzentrat
9、ion der Erythrozyten, Referenzmethode Teil 4: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration der Leukozyten Teil 5: Referenzverfahren zur Bestimmung der Konzentration der Thrombozyten. Es ist vorgesehen, Teil 5 durch einen Abschnitt, in dem ausgewhlte Verfahren enthalten sind, zu ergnzen. DIN 58
10、932-5:2007-10 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm gilt fr die Bestimmung der Konzentration der Thrombozyten im Humanblut mit einem Referenzverfahren oder einem ausgewhlten Verfahren. Sie gilt nur fr die analytische Phase. Die Einhaltung der in dieser Norm festgelegten gerte- und messtechnischen Anforde
11、rungen bei der Durchfhrung des Referenzverfahrens stellt sicher, dass die Konzentration der Thrombozyten im Blut mit einer mglichst geringen Messunsicherheit bestimmt wird. Die Anwendung eines ausgewhlten Verfahrens stellt die Vergleichbarkeit der in verschiedenen Laboratorien erhaltenen Ergebnisse
12、mit einer quantifizier-baren, den medizinischen Erfordernissen gengenden Messgenauigkeit sicher. Diese Norm gilt auch zur Partikelzhlung in stabilisierten Kontrollbluten mit fixierten humanen Blutkrperchen oder in Suspensionen mit Teilchen nicht biologischen Ursprungs (z. B. Kgelchen mit Oberflchena
13、ntigenen), wenn sich die zu messenden Partikel messtechnisch wie Thrombozyten (siehe 3.1) verhalten. Diese Norm gilt auch bei der Thrombozytenzhlung fr Patienten mit Strungen der Thrombozytenfunktion, bei denen eine Glanzmann-Thrombasthenie oder das Bernard-Soulier-Syndrom vorliegen, vorausgesetzt d
14、ie Forderungen in 6.2 werden eingehalten. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen D
15、okuments (einschlielich aller nderungen). DIN 58932-1, Hmatologie Bestimmung der Blutkrperchenkonzentration im Blut Teil 1: Blutentnahme, Probenvorbereitung, Einflussgren, Strfaktoren 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die Begriffe nach DIN 58932-1 und die folgenden Begriffe. 3.1 Th
16、rombozyten kernlose Blutkrperchen im menschlichen peripheren Blut mit Expression der Oberflchen-Antigene CD61, CD42 und CD41 3.2 Thrombozytenzhlgert Gert zur Zhlung suspendierter Teilchen, einschlielich Blutkrperchenzhlgerten und anderer Durchfluss-zytometer, mit dem die Teilchen (Thrombozyten) beim
17、 Durchstrmen des sensitiven Bereiches eines Messwertaufnehmers, der die Beobachtung der Fluoreszenz markierter Partikel erlaubt, nachgewiesen und die elektronischen Impulse anschlieend verarbeitet werden 3.3 Durchflusszytometrisches Messverfahren Messverfahren, bei dem sich die Konzentration der Thr
18、ombozyten im Blut ergibt aus der Anzahl der Thrombozyten, die whrend der Messung durch den sensitiven Bereich des Messwert-aufnehmers strmen, dem Messvolumen, DIN 58932-5:2007-10 5 dem Volumenanteil des Blutes in der Messsuspension ANMERKUNG Erluterungen siehe A.1 und Abschnitt 6. 3.4 Leerwertbestim
19、mung Messung unter Verwendung des Suspensionsmittels nach Zugabe aller zur Herstellung der Messsuspension erforderlichen Reagenzien, jedoch ohne Beifgung der Probe DIN 58932-4:2003-07 3.5 Untergrund Beitrag zum Messwert der Konzentration der Thrombozyten, verursacht durch nicht von Thrombozyten herr
20、hrende Impulse ANMERKUNG Der Untergrund kann verursacht werden durch Rauschen der Detektoren (Messwertaufnehmer) und von elektronischen Baugruppen, Impulse, die nicht durch Partikel erzeugt werden (z. B. durch Netzteile), Partikel im Suspensionsmittel. Die Auswirkungen dieser Strgren werden durch di
21、e Leerwertbestimmung nachgewiesen und quantifiziert. Weitere Beitrge zum Untergrund werden verursacht durch die zu untersuchende Probe, d. h. durch Matrixeffekte (Partikel in der Probe, die keine Thrombozyten sind, jedoch den Thrombozyten entsprechende Messsignale verursachen, z. B. Zellbruchstcke).
22、 3.6 Probe ungerinnbar gemachtes Blut humanen Ursprungs ANMERKUNG Als Antikoagulanz sollte EDTA zu bevorzugt werden. 3.7 Messsuspension die auf einen bestimmten Volumenanteil verdnnte Probe DIN 58932-4:2003-07 3.8 Messvolumen Volumen der Messsuspension, die whrend der Messung durch den Messwertaufne
23、hmer strmt DIN 58932-4:2003-07 4 Formelzeichen Formelzeichen Bedeutung Einheit a Ordinatenabschnitt der Regressionsgeraden 1 b Steigung der Regressionsgeraden 1 C Konzentration der Thrombozyten in der Probe L1DIN 58932-5:2007-10 6 Formelzeichen Bedeutung Einheit C0Festgelegte Thrombozytenkonzentrati
24、on, bei der die relative erweiterte Messunsicherheit 2ureleinen geforderten Wert nicht berschreiten darf L1Cri,jRegistrierte oder nach Gleichung (2) berechnete Konzentration der Thrombozyten in der Messsuspension i bei der Wiederholungsmessung j L1riC ber alle Wiederholungsmessungen j gemittelte reg
25、istrierte oder nach Gleichung (2) berechnete Konzentration der Thrombozytenn in der Messsuspension i L1Ci,jKonzentration der Thrombozyten in der Messsuspension i, bei der Wiederholungsmessung j (abgeleitet von der registrierten Konzentration Cri,jdurch Korrektur der Koinzidenzverluste) L1iC ber alle
26、 Wiederholungsmessungen j gemittelte Konzentration der Thrombozyten in der Messsuspension i L1k Anzahl der Wiederholungsmessungen; Stichprobenumfang 1 N Anzahl der Thrombozyten in einem Volumen V der Probe 1 Nri,jAnzahl der bei der Wiederholungsmessung j registrierten Thrombozyten in einem Volumen V
27、i,jder Messsuspension i 1 riN ber alle Wiederholungsmessungen j gemittelte Anzahl der registrierten Thrombozyten in einem Volumen V der Messsuspension i 1 Ni,jAnzahl der Thrombozyten in einem Volumen Vi,jder Messsuspension i bei der Wiederholungsmessung j (abgeleitet von der registrierten Anzahl Nri
28、,jdurch Korrektur der Koinzidenzverluste) 1 totaljri,N Gesamtanzahl aller bei der Wiederholungsmessung j registrierten Ereignisse in einem Volumen Vi,jder Messsuspension i p Koinzidenzparameter 1 SiStandardabweichung der Gre riN 1 SxFr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Werte x 1 Sx
29、2Fr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Quadrate der Werte x 1 SxyFr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Produkte xy 1 SyFr die Messunsicherheitsanalyse bentigte Summe ber die Werte y 1 TkritKritischer Wert beim Ausreiertest 1 ti,jMesszeit bei der Wiederholungsmessung
30、 j der Messsuspension i s u Standardmessunsicherheit Einheit der jeweiligen Messgreurelrelative Standardmessunsicherheit 1 V Volumen der Probe L Vi,jVolumen bei der Wiederholungsmessung j der Messsuspension i L DIN 58932-5:2007-10 7 Formelzeichen Bedeutung Einheit iV ber alle Wiederholungsmessungen
31、j gemitteltes Volumen Vi,jder Messsuspension i L Impulsauflsungszeit; Totzeit s iVolumenanteil der Probe in der Messsuspension i 1 5 Messgre und Einheit Die Messgre ist die Thrombozytenkonzentration in der Probe. Die Einheit der Messgre ist die auf die Probe bezogene reziproke Volumeneinheit L1oder
32、deren dezimale Teile. 6 Referenzverfahren 6.1 Anforderungen an das Thrombozytenzhlgert Als Referenzgert kann jedes nach dem durchflusszytometrischen Messverfahren arbeitende Zellzhlgert verwendet werden, sofern es ber einen geeigneten Messwertaufnehmer verfgt und die Unterscheidung der Thrombozyten
33、von anderen Zellpopulationen und Partikeln erlaubt. Das Gert muss so beschaffen und mit Zusatzeinrichtungen ausgestattet sein, dass die in Gleichungen (1) und (2) fr die Partikelkonzentrationen vorkommenden Gren mit den nachfolgend angegebenen erweiterten Messunsicherheiten 2u (entsprechend einem Ve
34、rtrauensniveau 95 % bei Annahme einer Normalverteilung) einzeln bestimmt werden knnen. V NC = (1) iji,jri,jri,=VNC (2) Dabei ist N die im Volumen V der Probe enthaltene Anzahl von Thrombozyten. N muss mit Hilfe der Methode der definierten Verdnnungsreihe zur Korrektur koinzidenzbedingter Zhlverluste
35、 mit einer relativen erweiterten Messunsicherheit 2urel (N) 5 % bestimmt sein (siehe 6.3 bis 6.7). Fr Thrombozytenkonzentrationen, die kleiner als C0= 20 000 L1sind, muss fr die relative erweiterte Messunsicherheit () ()CCNuNuCCCC00022 =relrelerfllt sein, d. h. es muss wegen 2urel (N) 5 % fr C0= 20
36、000 L1()CNuCC1relL000120 gelten. Die Berechnung von N erfolgt aus der bezglich des Untergrundes korrigierten Anzahl der registrierten Impulse Nri,j. Kann die automatische Koinzidenzkorrektur nicht ausgeschaltet werden, mssen die vom Messwertaufnehmer aufgenommenen, verstrkten Primrsignale verwendet
37、werden. Elektronische Totzeiten (Zeitkonstanten, Impulsbewertungszeiten) mssen vernachlssigbar klein gegen die Impulsauflsungszeit der verstrkten Detektorimpulse sein. DIN 58932-5:2007-10 8 Vi,jdas Volumen der Messsuspension i, die whrend der Messung j durch den sensitiven Bereich des Mess-wertaufne
38、hmers strmt. Dieses Volumen und damit das Volumen V mssen mit einer relativen erweiterten Messunsicherheit von 2urel (V) 0,6 % bestimmt sein. ANMERKUNG 1 Die Wiederholungsmessungen bei einer Verdnnung (d. h. Messsuspension) i werden durch den Index j gekennzeichnet; die Anzahl der registrierten Erei
39、gnisse ist Nri,jund das Volumen Vi,j. ider Volumenanteil der Probe in der Messsuspension i. Der Volumenanteil muss mit einer relativen erweiterten Messunsicherheit 2urel (i) 1 % bestimmt sein. ANMERKUNG 2 Die registrierte oder nach (2) berechnete Thrombozytenkonzentration Cri,jist wegen der Koinzide
40、nz-verluste geringer als die Thrombozytenkonzentration i C in der Messsuspension. Das Thrombozytenzhlgert muss fr jedes Partikel in der Messsuspension simultan die Fluoreszenz-intensitt in mindestens einem Emissionswellenlngenbereich und die Intensitt des in Vorwrtsrichtung oder in seitlicher Richtu
41、ng gestreuten Lichtes detektieren. ANMERKUNG 3 Eine zustzliche, simultane Messung der Fluoreszenzintensitt in einem zweitem Emissions-wellenlngenbereich wrde die Zuordnung der registrierten Ereignisse zu bestimmten Zellpopulationen sowie die Identifikation von Strfaktoren vereinfachen. Das Thrombozy
42、tenzhlgert muss mit einer berwachungseinrichtung fr die Messzeit ti,jund mit einem Impulshhenanalysator fr jede Messgre ausgerstet sein. Das Gert muss ber eine manuell oder automatisch einstellbare untere Diskriminatorschwelle verfgen. Die Zhlrate muss durch Wahl des Volumenanteils der Probe in der
43、Messsuspension so gering gewhlt werden, dass fr jede Messgre eine von den elektronischen Komponenten verursachte Basislinien-verschiebung die Messung nicht beeintrchtigt. Das Thrombozytenzhlgert sowie die verwendeten Gefe fr die Messsuspension mssen so beschaffen sein, dass ihre Einflsse auf die Par
44、tikelkonzentration durch statische Entmischungseffekte wie Sedimentation, Adhsion von Thrombozyten an Gef- und Schlauch-wnden, dynamische Entmischungseffekte (Fhraeus-Effekt), Untergrund, Verschleppung, minimiert sind und gegebenenfalls durch Korrekturen bercksichtigt werden knnen. Die relativen erw
45、eiterten Messunsicherheiten mssen einzeln untersucht oder wo dies nicht mglich ist abgeschtzt sein. Die erweiterten Messunsicherheiten dieser Korrekturen drfen zusammen 2 % bezogen auf die Thrombozytenkonzentration nicht bersteigen (quadratische Addition der Komponenten, Vertrauensniveau 95 %). Zur
46、Ermittlung des Einflusses der Adhsion der Thrombozyten an den Becherwandungen oder des Einflusses der Reagenzien wird die Thrombozytenkonzentration 30 s sowie 10 min nach Herstellung der Mess-suspension bestimmt. Die Messsuspension muss unmittelbar vor der Messung gemischt werden. Die Differenz der
47、beiden Messwerte darf 2 % des ersten Messwertes nicht bersteigen (Annahme einer linearen Zeitabhngigkeit der Adhsion). ANMERKUNG 4 Zur Probenvorbereitung eignen sich insbesondere Behlter oder Rhrchen aus Polypropylen. DIN 58932-5:2007-10 9 Die Abweichung der Thrombozytenkonzentrationen bei Messungen
48、 vor und nach fnfmaligem Umfllen der Suspension in einen jeweils frischen Probenbecher darf 2 % des ersten Messwertes nicht bersteigen. Fr Thrombozytenkonzentrationen, die grer oder gleich C0= 20 000 L1sind, muss die Gesamtanzahl der registrierten Ereignisse =kjN1jri,fr jede Messsuspension i so gro sein, dass die relative erweiterte Unsicherheit kleiner gleich 5 % ist 0502211,NNukjkj=jri,jri,rel. (3) Damit mssen mindestens 1 600 Ereignisse registriert werden, d. h. 60011=kjNjri,. Fr Thrombozytenkonzentrationen, die kleiner sind als C0= 20 000 L1, muss fr jede Messsuspens
