1、Mrz 2010DEUTSCHE NORM Normenausschuss Medizin (NAMed) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 11.100.30!$Zal“1556273www.din.deDDIN 58988Hmostaseolo
2、gie Referenzmethode zur Bestimmung der von Willebrand Faktor Multimere;Text Deutsch und EnglischHaemostaseology Reference method for the VWF multimeres; TextinGermanandEnglishHmostase Mthode de rfrence pour la dtermination des multimres du VWF; Texte en allemandet anglaisAlleinverkauf der Normen dur
3、ch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 13 SeitenDIN 58988:2010-03 Inhalt SeiteVorwort 31 Anwendungsbereich . 42 Normative Verweisungen 43 Begriffe . 44 Abkrzungen 55 Bezeichnung. 56 Entnahme und Aufbereitung des Blutes. 67 Durchfhrung. 67.1 Gerte, Materialien und Reagenzien . 67
4、.1.1 Gerte und Ausrstung. 77.1.2 Agarose. 77.1.3 Puffersysteme 77.1.4 Referenzmaterial 87.2 Durchfhrung der Bestimmung . 87.2.1 Allgemeine Richtlinien 87.2.2 Vorbereiten der Agarosegele 87.2.3 Probenvorbereitung. 97.2.4 Elektrophorese. 97.2.5 Detektion der VWF-Multimere. 97.3 Leistungsdaten 107.3.1
5、Mindestanforderungen 107.3.2 Kalibrier- und Messbereich. 108 Auswertung 108.1 Allgemeines 108.2 Visuelle Auswertung . 108.3 Densitometrische Auswertung. 118.4 Validierung des Testsystems . 118.5 Referenzintervall 119 Potentielle Interferenzen . 129.1 Probenvorbereitung. 129.2 Beeinflussung der Inter
6、pretation . 12Literaturhinweise 13Contents PageForeword 31 Scope.42 Normative references.43 Terms and definitions 44 Abbreviations .55 Designation.56 Collection and processing of blood67 Procedure67.1 Apparatus, materials and reagents.67.1.1 Apparatus and equipment.77.1.2 Agarose .77.1.3 Buffer syst
7、em .77.1.4 Reference material .87.2 Determination procedure.87.2.1 General guidelines .87.2.2 Preparation of the agarose gels .87.2.3 Sample preparation97.2.4 Electrophoresis 97.2.5 Detection of the VWF multimeres.97.3 Performance data .107.3.1 Minimum requirement107.3.2 Calibration and reportable r
8、ange108 Evaluation .108.1 General 108.2 Visual evaluation 108.3 Densitometric evaluation.118.4 Validation of the test system.118.5 Reference interval 119 Potential interferences.129.1 Sample preparation129.2 Influence on interpretation12Bibliography.132 DIN 58988:2010-03 Vorwort Diese Norm wurde vom
9、 NA 063-03-05 AA Hmo-staseologie“ des Normenausschusses Medizin (NAMed) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. erarbeitet. Foreword This standard has been prepared by NA 063-03-05 AA “Hmostaseologie” (Haemosta-seology) of Normenausschuss Medizin (NAMed)(Medical Standards Committee) in the DIN De
10、ut-sches Institut fr Normung e. V. (German Institute for Standardization). 3 DIN 58988:2010-03 1 Anwendungsbereich Diese Norm gilt fr die Bestimmung der Anzahl bzw. der Grenverteilung der Multimere des humanen von Willebrand Faktors sowie der Beur-teilung der Substrukturen der VWF-Multimere in Citra
11、tplasma oder in Faktorenkonzentraten. 1 Scope This standard applies to the determination of the number or the size distribution, respectively, of the multimeres of the human von Willebrand factor as well as the assessment of the substructures of the VWF multimeres in citrated plasma or in factor con
12、centrates. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisun-gen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genom-menen Dokuments (einschlielich aller
13、 nderun-gen). 2 Normative references The following referenced documents are indispens-able for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies. DIN 58909-1
14、, Hmostaseologie Bestimmung der Faktor VIII-Gerinnungsaktivitt (F VIII C) Teil 1: Referenzmessverfahren fr die Einstufen-methode DIN 58909-1, Haemostaseology Determination of factor VIII coagulant activity (F VIII C) Part 1: Reference measurement procedure for the one-stage method 3 Begriffe Fr die
15、Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3 Terms and definitions For the purposes of this document, the following terms and definitions apply. 3.1 von Willebrand Faktor humanes Glykoprotein groer Moleklmasse, das in der primren Hmostase sowohl fr die Inter-aktion zwischen Thrombozyt
16、 und Gefwand als auch von Thrombozyten untereinander verant-wortlich ist, und in der sekundren Hmostase das Trgerprotein des F VIII ist und dessen Genort auf dem kurzen Arm des Chromosoms 12 liegt 3.1 von Willebrand factor human glycoprotein of high molecular mass which, in primary haemostasis, is r
17、esponsible for both the interaction between the thrombocytes and the vascular wall and the interaction of the thrombo-cytes among each other and, in secondary haemo-stasis, is the carrier protein of the F VIII, and whose gene locus is on the short arm of chromo-some 12 4 DIN 58988:2010-03 3.2 VWF-Mu
18、ltimere Oligomere und Polymere des VWF Monomers ANMERKUNG VWF wird als monomeres Polypeptidvon 2 050 Aminosuren exprimiert und durch posttrans-lationale Modifizierungsschritte einschlielich der Bildungvon intramolekularen Disulfidbrcken zu Oligo- und Poly-meren polymerisiert. Diese, auch als Multime
19、re bezeich-neten Polymere haben Moleklmassen von bis zu20 Millionen Dalton oder mehr. In Plasma und in pharma-zeutischen Prparaten liegt VWF in Mischungen vonMultimeren verschiedener Moleklmassen vor, die durchdie Methode der Bestimmung der VWF-Multimere sicht-bar gemacht und semiquantitativ bestimm
20、t werdenknnen 1, 2. Darber hinaus erlaubt die Methode auchdie charakteristische Substruktur, die so genanntenSatellitenbanden, von VWF zu analysieren, die durchlimitierte Proteolyse durch ADAMTS 13 entsteht.ADAMTS 13 ist eine spezifische Protease, welche alsphysiologisches Enzym den Multimerisierung
21、sgrad vonVWF reguliert 3. 3.2 VWF multimeres oligomeres and polymeres of the VWF monomer Note VWF is expressed as a monomere polypeptide of2 050 amino acids and polymerized, by means ofposttranslational modification steps including the for-mation of intramolecular disulphide bridges, to form oligo-m
22、eres and polymeres. These polymeres, which are alsocalled multimeres, exhibit molecular masses of up to20 million daltons or more. In plasma and in pharma-ceutical preparations, VWF is present in the form ofmixtures of multimeres with various molecular masseswhich can be made visible, and determined
23、 semi-quanti-tatively, by the method of determining the VWF multi-meres 1, 2. Furthermore, the method enables to ana-lyze the characteristic substructure, i.e., the so-calledsatellite bands, of the VWF which is the result of limitedproteolysis by means of ADAMTS 13. ADAMTS 13 is aspecific protease w
24、hich, in its function as a physiologicalenzyme, regulates the degree of multimerization of VWF3. 4 Abkrzungen 4 Abbreviations Tabelle 1/Table 1 Abkrzungen, die in der Norm verwendet werden/ Abbreviations used in the standard Abkrzung/Abbreviation Vollstndige Bezeichnung/Full name SDS Sodiumdodecylsu
25、lphat/Sodium dodecyl sulphate Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan/Tris(hydroxymethyl)aminomethane EDTA Ethylendiaminotetraessigsure/Ethylenediamine tetraacetic acid VWF von Willebrand Faktor/von Willebrand factor VWS von Willebrand Syndrom/von Willebrand syndrom VWF:Ag von Willebrand Faktor Antigen/
26、von Willebrand factor antigen VWF:RCo von Willebrand Faktor Ristocetin-Cofaktor Aktivitt/von Willebrand factor risto-cetin cofactor activity VWF:CB von Willebrand Faktor Collagenbindungsaktivitt/von Willebrand factor collagen binding activity 5 Bezeichnung Bezeichnung der Bestimmung und Charakteri-s
27、ierung des Grades und der Struktur des Poly-merisierungsgrades der VWF-Multimere ist Bestimmung DIN 58988 VWF:Multimere 5 Designation The designation of the determination and charac-terization of the degree and the structure of the degree of polymerization of the VWF multimeres is Determination DIN
28、58988 VWF:Multimeres 5 DIN 58988:2010-03 6 Entnahme und Aufbereitung des Blutes 6 Collection and processing of blood Entnahme und Aufbereitung des Blutes erfolgen nach DIN 58909-1. Blood collection and processing are performed in accordance with DIN 58909-1. Im Gegensatz zu vielen anderen Gerinnungs
29、-proteinen ist der VWF relativ stabil. Transport von Plasma oder Blut bei Raumtemperatur fhrt zu keinerlei Vernderungen, solange 48 h nicht ber-schritten werden. Danach kommt es zu einem graduellen Verlust groer Multimere und zu einem dysproportionalen Abfall funktioneller Teste, wh-rend das VWF:Ag
30、ber noch lngere Zeit stabil bleibt. Hmolytische Proben knnen ein Hinweis auf fehlerhafte Blutentnahme und Lagerung sein. Die Transport- und Lagerungsbedingungen sind der Tabelle 2 zu entnehmen. In contrast to many other coagulation proteins, the VWF is relatively stable. The transport of plasma or b
31、lood at room temperature does not lead to any modifications, as long as a duration of 48 h is not exceeded. Afterwards a gradual loss of large multi-meres and a dysproportionate reduction in functio-nal tests will occur, while the VWF:Ag remains stable for a longer period of time. Haemolytic samples
32、 can be an indication of improper blood collection and storage. The transport and storage conditions shall be derived from Table 2. Tabelle 2/Table 2 Transport- und Lagerbedingungen/Transport and storage conditions Probea/SampleaTemperatur/Temperature Zeit/Time Citratblut/Citrated blood Raumtemperat
33、ur/ Room temperature 48 h Citratplasma/Citrated plasma Raumtemperatur/ Room temperature 48 h Citratplasma/Citrated plasma 20 Cb 12 Monate/ 12 months Citratplasma/Citrated plasma 70 Cb 24 Monate/ 24 months aLagerung und Transport bei Khlschranktemperatur ist nicht geeignet, da dies zu qualitativen Ve
34、rnderungen fhrt (Vortuschung von VWS Typ 2)./Storage and transport at refrigerator temperature are unsuitable as they result in qualitative changes (pseudo-type 2 VWF). bDer Auftauvorgang sollte bei 37 C ohne Zentrifugation durchgefhrt werden./Thawing should be performed at 37 C without centrifugati
35、on. 7 Durchfhrung 7 Procedure 7.1 Gerte, Materialien und Reagenzien 7.1 Apparatus, materials and reagents Die verschiedenen Multimere des VWF lassen sichdurch SDS-Gelelektrophorese in einem groporigenTrgermaterial im elektrischen Feld auftrennen. BeiVerwendung von einem etwa 1%igen Agarosegellsst si
36、ch das Multimerenspektrum qualitativ undsemiquantitativ analysieren. Verwendet manhherprozentige Gele (z. B. 1,5 %ige bis 3%igeAgarose) so lassen sich auch Substrukturen derverschiedenen Multimere visualisieren. The different VWF multimeres can be separated in in the electric field in a large-pored
37、substrate, by means of SDS gel electrophoresis. When using an agarose gel of approximately 1 %, the multimere spectrum can be analyzed qualitatively and semi-quantitatively. If gels with a higher percentage are used (e.g., 1,5 % to 3 % agarose), it is also possi-ble to visualize the substructures of
38、 the differentmultimeres. 6 DIN 58988:2010-03 Die so getrennten VWF-Multimere werden an-schlieend durch geeignete Methoden detektiert. Dies kann durch direkte Immunfrbung im Agaro-segel oder durch Blotting und anschlieende Frbung mit spezifischen Antikrpern, mit Lumi-neszenz- oder Chemolumineszenz-M
39、ethoden so-wie mit autoradiographischen Nachweismethoden erfolgen. Dokumentiert wird entweder die Anzahl der zhlbaren Multimerenbanden oder es wird zur Auswertung die densitometrisch bestimmte Vertei-lung der Bandenintensitten herangezogen. Subsequently, the VWF multimeres thus separated are detecte
40、d by suitable methods. This may also be performed by direct immunostaining in the agarose gel or by blotting and subsequent colour-ation using specific antibodies, with luminescence or chemiluminescence methods as well as with autoradiographic detection methods. Documen-tation is made of either the
41、number of the countable multimere bands, or the densitometri-cally determined distribution of the band intensitiesis used for evaluation. 7.1.1 Gerte und Ausrstung 7.1.1 Apparatus and equipment Elektrophoreseapparatur mit Khlung; Stromversorgung; Scanner zur densitometrischen Analyse; gertespezifisc
42、he Zusatzausrstung wie PC und Auswertesoftware; kalibrierte Pipetten; Wasserbad; Waage; Mikrowellenofen; Schttler; Kunststofffolie mit einer hydrophilen Seite. electrophoresis apparatus with cooling; power supply; scanner for densitometric analysis; apparatus-specific additional equipment such as PC
43、 and evaluation software; calibrated pipettes; water bath; balance; microwave oven; shaker; plastics foil with a hydrophilic side. 7.1.2 Agarose Es knnen handelsbliche zur elektrophoretischen Anwendung geeignete Agarosen verwendet wer-den. Die Verwendung von Agarosen sowohl mit niedriger als auch mi
44、t hoher Geliertemperatur ist in der Literatur beschrieben. 7.1.2 Agarose Commercially available agaroses suitable for electrophoretic application can be used. The application of agaroses with both low and high gelation time is described in the literature. 7.1.3 Puffersysteme Sowohl fr das Gieen des
45、Sammelgels, des Trenngels als auch fr den Laufpuffer werden Pufferlsungen mit SDS verwendet, meist Tris-Glycin-Lsungen mit etwa 0,1 % SDS. Die pH-Werte der Pufferlsungen fr das Trenngel liegen um pH 8, fr das Sammelgel meist bei pH 6,8. Als Probenvorbereitungspuffer werden ebenfalls SDS-haltige Puff
46、erlsungen verwendet, hier werden hufig noch EDTA (z. B. 1 mM) und ein Farbstoff zur Markierung der Pufferfront (z. B. Bromphenol-blau) zugesetzt. 7.1.3 Buffer system Both for pouring the stacking gel and the separating gel and for the running buffer, buffer solutions with SDS are used, mostly tris-g
47、lycine solutions containing approximately 0,1 % SDS.The pH values of the buffer solutions for the separating gel are close to 8, those for the stacking gel are mostly close to 6,8. The sample preparation buffers used are also SDS-containing buffer solutions; here often EDTA (e.g., 1 mM) and a colour
48、 marker for the buffer front (e.g., brom-phenol blue) are added. 7 DIN 58988:2010-03 7.1.4 Referenzmaterial Es existiert zur Zeit kein internationales Referenz-material fr VWF-Multimere. Als Kalibrationsmate-rial ist ein humanes Normalplasma zu verwenden, das 1 U VWF:Ag/ml 0,2 U VWF:Ag/ml enthalten
49、soll (siehe DIN 58911-1 und DIN 58911-2). Dieses Kalibrationsmaterial wird dann analog zu den Proben auf den gewnschten VWF-Antigengehalt verdnnt. Alternativ kann Plasmapool oder lyophilisiertes Normalplasma verwendet werden, wenn eine normale Verteilung und ein normales Bandenmuster sichergestellt sind. Bei diesen Mate-rialien kann ein Verlust von Multimeren auftreten. 7.1.4 Reference material Curren
