1、Juli 2003VornormLebensmittelBestimmung von Neohesperidin-Dihydrochalcon mitHochleistungsflssigkeitschromatographie (HPLC)Deutsche Fassung CEN/TS 14537:2003 CEN/TS 14537ICS 67.050Foodstuffs Determination of neohesperidin-dihydrochalconby high-performance liquid chromatography (HPLC);German version CE
2、N/TS 14537:2003Denres alimentaires Dosage de la nohespridine-dihydrochalconepar chromatography liquide de haute performance (CLHP),Version allemande CEN/TS 14537:2003Eine technische Spezifikation (Vornorm) ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmterVorbehalte zum Inhalt oder wegen de
3、s gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vomDIN noch nicht als Norm herausgegeben wird.Zur vorliegenden Vornorm wurde kein Entwurf verffentlicht.Erfahrungen mit dieser Vornorm sind erbeten an den Normenausschuss Lebensmittel undlandwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Ins
4、titut fr Normung e.V., 10772 Berlin(Hausanschrift: Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin).Nationales VorwortDiese Europische Technische Spezifikation ist vom Technischen Komitee CEN/TC 275Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren (Sekretariat: DIN) erarbeitet worden.Die Mitarbeit des DIN wird ber den Arb
5、eitsausschuss Sstoffe des Normenausschusses Lebensmittelund landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen.Fr die im Abschnitt 2 und im Anhang A zitierten Internationalen Normen wird im Folgenden auf dieentsprechenden Deutschen Normen hingewiesen:EN ISO 3696 siehe DIN ISO 3696ISO 5725 siehe DIN ISO
6、 5725Fortsetzung Seite 2und 12 Seiten CEN/TSNormenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. .Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, Ref. Nr. DIN CEN/TS 14537:2003-07nur mit Genehmigung des
7、DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet. Preisgr. 10 Vertr.-Nr. 0010Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinVornormDIN CEN/TS 14537:2003-072Nationaler Anhang A(informativ)LiteraturhinweiseDIN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen;
8、Identisch mitISO 3696:1987.DIN ISO 5725, Przision von Prfverfahren Bestimmung der Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeitfr ein Standardprfverfahren durch Ringversuche; Identisch mit ISO 5725:1986.Vornorm TECHNISCHE SPEZIFIKATIONTECHNICAL SPECIFICATIONSPCIFICATION TECHNIQUECEN/TS 14537April 2003ICS
9、67.050Deutsche FassungLebensmittel Bestimmung von Neohesperidin-Dihydrochalconmit Hochleistungsflssigkeitschromatographie (HPLC)Foodstuffs Determination of neohesperidin-dihydrochalconby high-performance liquid chromatography (HPLC)Denres alimentaires Dosage de la nohespridine-dihydrochalcone par ch
10、romatography liquide de hauteperformance (CLHP)Diese Technische Spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 5. Januar 2003 zur vorlufigen Anwendung angenommen.Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihreStellungnahmen
11、 abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann.Die CEN-Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und dieCEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale
12、Normen bis zur Entscheidung ber eine mglicheUmwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten.CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland,Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen
13、, sterreich, Portugal, Schweden, Schweiz, der Slowakei, Spanien, derTschechischen Republik, Ungarn und dem Vereinigten Knigreich.EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNGEUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATIONCOMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2002 CEN Alle Recht
14、e der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchemVerfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. CEN/TS 14537:2003 DCEN/TS 14537:2003 (D)2InhaltSeiteVorwort 31 Anwendungsbereich. 32 Normative Verweisungen . 33 Kurzbeschreibung. 34 Chemikalien . 35 Gerte . 46 Du
15、rchfhrung 57 Berechnung . 68 Przision 79 Untersuchungsbericht 7Anhang A (informativ) Przisionsdaten 8Anhang B (informativ) Alternative HPLC-Systeme 9Anhang C (informativ) Beispiel fr ein Chromatogramm . 10Literaturhinweise 12Vornorm CEN/TS 14537:2003 (D)3VorwortDieses Dokument CEN/TS 14537:2003 wurd
16、e vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird.Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lndergehalten, diese Technische Spezifikation anzukndigen: Belgien, Dn
17、emark, Deutschland, Finnland, Frankreich,Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, die Niederlande, Norwegen, sterreich, Portugal,Schweden, die Schweiz, die Slowakei, Spanien, die Tschechische Republik, Ungarn und das VereinigteKnigreich.Die Anhnge A, B und C sind informativ.1 Anwendu
18、ngsbereichDiese Technische Spezifikation legt ein HPLC-Verfahren fr die Bestimmung von Neohesperidin-Dihydrochalcon(NHDC) in Lebensmitteln fest.Das Verfahren wurde in einem Ringversuch an Kirschjoghurt mit 42,7 mg/kg und an einem Multivitamingetrnk mit35,6 mg/l NHDC geprft 1.Das Verfahren wurde auer
19、dem erfolgreich fr eine Reihe anderer Lebensmittel angewandt, wie Marzipan,Backwaren, Sahne, Puddingpulver, Schokolade und Eiskrem.2 Normative VerweisungenDiese Technische Spezifikation enthlt durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderenPublikationen. Diese normativen Verweis
20、ungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationensind nachstehend aufgefhrt. Bei datierten Verweisungen gehren sptere nderungen oder berarbeitungendieser Publikationen nur zu dieser Technischen Spezifikation, falls sie durch nderung oder berarbeitungeingearbeitet sind. Bei
21、undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation(einschlielich nderungen).EN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen (ISO 3696:1987).3 KurzbeschreibungDie Probe wird mit Methanol oder einer Methanol/Wassermischung extrahiert und bei Bedar
22、f filtriert. NHDC wirdmit HPLC an einer Umkehrphase getrennt, spektralphotometrisch detektiert, und mit externem Standard bestimmt1.4 Chemikalien4.1 AllgemeinesFalls nicht anders angegeben, werden bei der Untersuchung nur analysenreine Chemikalien und Wasser derQualitt 1 nach EN ISO 3696 oder destil
23、liertes Wasser verwendet.Vornorm CEN/TS 14537:2003 (D)44.2 Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat-Lsung (Mobile Phase A) fr HPLC geeignet,Stoffmengenkonzentration c = 0,01 mol/l.4.3 Methanol (Mobile Phase B)4.4 HPLC Mobile PhaseFr die Mobile Phase werden geeignete Mischungen von Tetra-n-butylammoniumhy
24、drogensulfat-Lsung (4.2) undMethanol (4.3) angewendet (z. B. Gradient nach 6.3.1). Die Mobile Phase wird vor Verwendung durch einenMembranfilter (5.2) filtriert.4.5 StandardsubstanzDie NHDC Standardsubstanz muss die Anforderungen nach der EU-Richtlinie 95/31/EU erfllen 2.Kommerziell erhltliches NHDC
25、 kann 4 Mole Kristallwasser enthalten. Wenn dieses kommerziell erhltliche NDHCverwendet wird, wird der Wassergehalt bercksichtigt. Das Molgewicht von trockenem NDHC betrgt 612,6 g/mol.4.6 StandardmesslsungenEine geeignete Menge an NHDC wird in einer Methanol/Wasser-Mischung (50 + 50, Volumenanteil)
26、gelst. UmStandardmesslsungen zu erhalten, die Peaks ergeben, die mit denen der Probenmesslsung vergleichbar sind,wird diese Lsung wiederum in einer Methanol/Wasser-Mischung (50 + 50, Volumenanteil) gelst.Diese Lsung darf 3 Monate im Khlschrank bei + 4 C aufbewahrt werden.5 Gertebliche Laborgerte und
27、 insbesondere die Folgenden:5.1 Filtervorrichtung, z. B. Filtereinheit fr Unterdruck, aus Glas, bestehend aus einer Glasfritte D2(Durchmesser 50 mm), 250 ml Trichteraufsatz und 1-l-Erlenmeyerkolben, jeweils mit Schliff.5.2 Membranfilter zum Filtern der Mobilen Phase, Porengre 0,45 m (oder weniger).A
28、NMERKUNG Das Filtern der Mobilen Phase und der Probenmesslsung durch einen Membranfilter vor der Verwendungoder Injektion verlngert vermutlich die Haltbarkeit der Sulen.5.3 Ultraschallbad5.4 Beutelwalkmischer, optional, z. B. zur Extraktion und Vorbereitung fester Proben.5.5 HPLC-System, bestehend a
29、us einer Pumpe; einem Einspritzblock; einem UV-Detektor mit variabler Wellenlngeneinstellung; einem Auswertesystem.Vornorm CEN/TS 14537:2003 (D)55.6 HPLC-SuleAnalytische Umkehrphasen-Trennsule, sureresistent, Durchmesser 4 mm, Lnge 250 mm, gefllt mit Teilchen-gren von 5 m, z. B. LiChrospher60 RP-sel
30、ect B1), oder einer anderen sureresistenten RP-Phase. ZumSchutz der Trennsule wird empfohlen, eine Vorsule mit gleichen Eigenschaften vorzuschalten.Andere Sulendimensionen als die in dieser Vornorm festgelegten drfen verwendet werden (z. B. Durchmesser3,0 mm bis 4,6 mm, Lnge 100 mm bis 250 mm). Tren
31、nparameter (Durchfluss, Injektionsvolumen) msseneingestellt werden, um gleichwertige Ergebnisse sicherzustellen.6 Durchfhrung6.1 Vorbereitung der UntersuchungsprobeDie Untersuchungsprobe wird homogenisiert. Flssige Proben werden geschttelt, viskose und halbfeste Probenwerden durch Rhren homogenisier
32、t, und feste Proben werden mit einem geeigneten Zerkleinerungsgertgemahlen und gemischt.6.2 Vorbereitung der Probenmesslsung6.2.1 Flssige Proben50 ml der Probe werden in einen 100-ml-Messkolben mit Methanol bis zur Marke aufgefllt, gemischt und 10 minmit Ultraschall behandelt. Die Suspension wird du
33、rch einen Faltenfilter und dann durch einen Membranfilter (5.2)filtriert.6.2.2 Viskose und halbfeste Proben10 g homogenisierte Probe werden in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und mit 50 ml Methanol versetzt. DerKolben wird geschttelt und 10 min mit Ultraschall behandelt. Der Kolben wird bis zum A
34、bkhlen auf Raum-temperatur stehengelassen und mit Wasser bis zur Marke aufgefllt. Diese Suspension wird wiederum 10 min mitUltraschall behandelt, durch einen Faltenfilter und dann durch einen Membranfilter (5.2) filtriert.ANMERKUNG Im Ringversuch mit Kirschjoghurt hat es sich herausgestellt, dass da
35、s Volumen der unlslichen Bestandteilewahrscheinlich nicht mehr als 1 % des Gesamtvolumens einnimmt. In diesem Fall muss das Volumen des Extraktes nichtkorrigiert werden.6.2.3 Feste Proben10 g homogenisierte Probe werden in einen Beutel eines Walkmischers gefllt, mit 50 ml Methanol und mit 50 mlWasse
36、r abzglich des bereits in der Probe enthaltenen Wassers versetzt. Der Beutel wird geschttelt, in einenBeutelwalkmischer gehngt und 10 min gewalkt. Die Suspension wird durch einen Faltenfilter und dann durcheinen Membranfilter (5.2) filtriert.6.3 HPLC-Bestimmung6.3.1 HPLC-BedingungenDie Trennung und
37、Bestimmung hat sich als zufrieden stellend erwiesen, wenn die folgenden Bedingungeneingehalten werden:Stationre Phase: nach 5.6.Mobile Phase: Gradient nach Tabelle 1:1)LiChrospher60 RP-select B ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zurUnterrichtung der Anw
38、ender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produktes durch CEN.Vornorm CEN/TS 14537:2003 (D)6Tabelle 1 Gradient fr Mobile PhasenZeitminEluent A%Eluent B%04102530408585704055151530609595Durchfluss: 1,2 ml/minInjektionsvolumen: 20 lDetektion: UV, bei 285 nm6.3.2 IdentifizierungGlei
39、che Volumina, z. B. 20 l der Standardmesslsung (4.6) sowie der Probenmesslsung (6.2) werden in dasHPLC-System (5.5) injiziert.NHDC wird durch Vergleich der Retentionszeit des Peaks der Probenmesslsung mit der der Standardmesslsungidentifiziert. Die Identifizierung kann auch ber die gleichzeitige Inj
40、ektion von kleinen Mengen an entsprechendenStandardmesslsungen zur Probenmesslsung und durch berprfung der Peakreinheit im UV-VIS-Spektrum,beispielsweise mit einem Diodenarray-Spektralphotometer, erfolgen.6.3.3 BestimmungDie Bestimmung mit externem Standard erfolgt entweder durch Integration der Pea
41、kflche bzw. durch Ermittlungder Peakhhen der Probe und durch Vergleich mit den entsprechenden Werten der Standardsubstanz oder miteiner Kalibriergeraden. Die Linearitt der Kalibriergeraden muss geprft werden.7 BerechnungDie Massenkonzentration an NHDC, , in Milligramm je Liter oder der Massenanteil,
42、 w, in Milligramm je KilogrammProbe wird nach Gleichung (1) berechnet:1000 oder 022111=mVAmVAw (1)Dabei ist:A1die Peakflche fr NHDC in der Probenmesslsung (6.2), in Flcheneinheiten;A2die Peakflche fr NHDC in der Standardmesslsung (4.6), in Flcheneinheiten;V1das Gesamtvolumen der Probenmesslsung (6.2
43、), in Milliliter;V2das Gesamtvolumen der Standardmesslsung (4.6), in Milliliter;m1die Masse an (trockenem) NHDC, enthalten in V2, in Milligramm;m0die Probenmenge, in Milliliter oder Gramm.Das Ergebnis wird ohne Kommastellen angegeben.Vornorm CEN/TS 14537:2003 (D)78 Przision8.1 GeneralDie Przisionsda
44、ten fr die Bestimmung von NHDC sind in einem Ringversuch im Jahre 1999 an Kirschjoghurt undeinem Multivitamingetrnk bestimmt worden, wie in Anhang A gezeigt. Die Werte, die in diesem Ringversuchermittelt wurden, sind nicht unbedingt auf andere Konzentrationsbereiche des Analyten und andere Proben-Ma
45、trices anwendbar, als in Anhang A angegeben.8.2 WiederholgrenzeDie absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Ergebnissen, die ein einzelner Bearbeiter an identischem Unter-suchungsmaterial mit denselben Gerten innerhalb der krzesten mglichen Zeitspanne erhlt, wird die Wiederhol-grenze r nicht hufig
46、er als in 5 % der Flle berschreiten.Die Werte fr NHDC sind:Kirschjoghurtx = 42,7 mg/kgr = 2,6 mg/kgMultivitamingetrnkx = 35,6 mg/lr = 1,8 mg/l8.3 VergleichgrenzeDie absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Ergebnissen, die von zwei Laboratorien fr identisches Unter-suchungsmaterial erhalten werden
47、, wird die Vergleichgrenze R nicht hufiger als in 5 % der Flle berschreiten.Die Werte fr NHDC sind:Kirschjoghurtx = 42,7 mg/kgR = 9,8 mg/kgMultivitamingetrnkx = 35,6 mg/lR = 5,4 mg/l9 UntersuchungsberichtIm Untersuchungsbericht sind mindestens anzugeben:a) alle notwendigen Informationen zur Identifi
48、zierung der Probe (Art, Herkunft, Bezeichnung der Probe);b) eine Verweisung auf diese Technische Spezifikation oder das verwendete Verfahren;c) Datum und Art der Probenahme (wenn bekannt);d) Datum des Probeneingangs;e) Datum der Untersuchung;f) die Ergebnisse und Einheiten, in denen sie angegeben we
49、rden;g) alle Besonderheiten, die whrend der Untersuchung festgestellt wurden;h) alle Arbeitsschritte, die nicht in diesem Verfahren festgelegt sind, wahlweise vorgenommen wurden und dasErgebnis mglicherweise beeinflusst haben.Vornorm CEN/TS 14537:2003 (D)8Anhang A(informativ)PrzisionsdatenDie folgenden Przisionsdaten sind in einem internationale
