1、April 2012 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30; 67.050Zur Erst
2、ellung einer DIN SPEC knnen verschiedene Verfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$sPg“1804568www.din.deDDIN CEN/TS 15634-2Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit molekularbiologischenVerfahren Teil 2: Selleri
3、e (Apium graveolens) - Qualitative Bestimmung einerspezifischen DNA-Sequenz in Brhwrsten mittels Real-time-PCR;Deutsche Fassung CEN/TS 15634-2:2012Foodstuffs Detection of food allergens by molecular biological methods Part 2: Celery (Apium graveolens) - Qualitative determination of a specific DNA se
4、quencein cooked sausages by real-time PCR;German version CEN/TS 15634-2:2012Produits alimentaires Dtection des allergnes alimentaires par des mthodes danalyse de biologiemolculaire Partie 2: Clerie (Apium graveolens) - Dtermination qualitative dune squence dADNspcifique dans des saucisses cuites par
5、 PCR en temps rel;Version allemande CEN/TS 15634-2:2012Alleinverkauf der Spezifikationen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 20 SeitenDIN SPEC 10701-1DIN CEN/TS 15634-2 (DIN SPEC 10701-1):2012-04 2 Nationales Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 15634-2:2012) wurde vom Technisc
6、hen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel-analytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN (Deutschland) gehalten wird. Das zustndige deutsche Normungsgremium ist der Arbeitsausschuss NA 057-01-05 AA Lebensmittelallergene“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Pr
7、odukte (NAL) im DIN e. V Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Zur vorliegenden DIN SPEC wurde k
8、ein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss Lebensmittel und
9、landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 15634-2 Februar 2012 ICS 07.100.30; 67.050 Deutsche Fassung Lebensmittel - Nachweis von Lebensmittelallergene
10、n mit molekularbiologischen Verfahren - Teil 2: Sellerie (Apium graveolens) - Qualitative Bestimmung einer spezifischen DNA-Sequenz in Brhwrsten mittels Real-time-PCR Foodstuffs - Detection of food allergens by molecular biological methods - Part 2: Celery (Apium graveolens) - Qualitative determinat
11、ion of a specific DNA sequence in cooked sausages by real-time PCR Produits alimentaires - Dtection des allergnes alimentaires par des mthodes danalyse de biologie molculaire - Partie 2: Cleri (Apium graveolens) - Dtermination qualitative dune squence dADN spcifique dans des saucisses cuites par PCR
12、 en temps rel Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 15. November 2011 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzug
13、eben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und die CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Norm
14、en bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland,
15、Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, der Trkei, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2012 CEN Alle
16、Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. CEN/TS 15634-2 D E U ROP I S C H E SKOM I T E EF RNOR M U NGEUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION CO M I T E U RO P E N DE N O R M A L I S AT I ONCEN/TS 156
17、34-2:2012 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Kurzbeschreibung .4 3 Reagenzien .4 4 Gerte und Ausrstungen 6 5 Analysenschritte 6 6 Validierungsstatus und Leistungskriterien .12 7 Probenart und -mengen 14 8 Nachweisgrenze .14 9 Strungen .15 10 Untersuchungsbericht 15 11 Untersuchung
18、en zur Leistungsfhigkeit des Verfahrens 15 Literaturhinweise 18 DIN CEN/TS 15634-2 (DIN SPEC 10701-1):2012-04 CEN/TS 15634-2:2012 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 15634-2:2012) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel-analytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat v
19、om DIN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nati
20、onalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diesen anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schwed
21、en, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Trkei, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN CEN/TS 15634-2 (DIN SPEC 10701-1):2012-04 CEN/TS 15634-2:2012 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation legt ein Verfahren fr den qualitativen Nachweis von Sellerie (
22、Apium graveolens) in Brhwrsten (z. B. Frankfurter, Wiener) fest. Der Nachweis von Sellerie mittels Real-time-PCR beruht auf der Vervielfltigung einer 101 bp (Basenpaar) langen Sequenz aus dem Gen der Mannitoldehydrogenase (GenBank Acc. No. AF067082) von Sellerie (Apium graveolens). Das Verfahren wur
23、de an mit Sellerie dotierten Brhwrsten (Bayrischer Leberkse) validiert. Zu diesem Zweck wurde ein Fleischbrt bestehend aus Massenanteilen von 50 % Schweinefleisch, 25 % Schweinefett, 23 % zerstoenem Eis und 1,8 % einer Mischung aus Natriumchlorid, Nitrit, Nitrat, Phosphaten und Ascorbaten nach einem
24、 Standardverfahren fr Brhwrste hergestellt. Das Fleischbrt wurde mit gemahlener Selleriesaat oder alternativ mit Sellerieknollenpulver jeweils auf die Dotierungsstufe 1 000 mg/kg aufgestockt. Niedrigere Dotierungsstufen wurden durch Verdnnung mit selleriefreiem Fleischbrt erhalten. Das Brt wurde in
25、Gefe abgefllt und fr 60 min auf 65 C erwrmt 2. 2 Kurzbeschreibung Die gesamte DNA der Brhwrste wird aus der Probenmatrix isoliert. DNA wird aus der Probenmatrix unter Verwendung von Cetyltrimethylammoniumbromid (en: cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) freigesetzt. Potentielle PCR-Inhibitoren werde
26、n von der isolierten DNA durch eine Reinigung ber Festphasensulen entfernt. Real-time-PCR wird zum Nachweis, zur Amplifikation und zur Quantifizierung einer sellerie-spezifischen Sequenz eingesetzt. Dieses Verfahren mit Real-time-PCR beinhaltet ein Fluoreszenzverfahren mit einer sequenzspezifischen
27、Hydrolyse 1, 2. 3 Reagenzien 3.1 Allgemeines Die folgenden allgemeinen Bedingungen fr die Analyse mssen befolgt werden, sofern nicht anders festgelegt. Es werden nur analysenreine, fr die Molekularbiologie geeignete Reagenzien verwendet. Die Reagenzien mssen in Form von kleinen Aliquoten aufbewahrt
28、werden, um das Risiko einer Verunreinigung auf ein Minimum zu verringern. Das gesamte verwendete Wasser muss frei von DNA oder Nukleasen sein, z. B. bidestilliert oder von gleichwertiger Qualitt (Reinheitsgrad fr die Molekularbiologie). Sofern nicht anderweitig festgelegt, mssen die Lsungen durch Ls
29、en der entsprechenden Reagenzien in Wasser hergestellt und autoklaviert werden. 3.2 Extraktionsreagenzien 3.2.1 Chloroform, CAS 66-67-3. 3.2.2 Ethanol, Volumenanteil = 70 %, CAS 64-17-5. 3.2.3 Ethylendiamintetraessigsure-Dinatriumsalz (Na2EDTA), CAS 6381-92-6. 3.2.4 Cetyltrimethylammoniumbromid (CTA
30、B), CAS 57-09-0. 3.2.5 Salzsure, = 37 %, CAS 7647-01-0. 3.2.6 Isoamylalkohol, CAS 123-51-3. 3.2.7 Isopropanol, CAS 67-63-0. 3.2.8 Proteinase K, EC 3.4.21.64. 3.2.9 Natriumchlorid, CAS 7647-14-5. DIN CEN/TS 15634-2 (DIN SPEC 10701-1):2012-04 CEN/TS 15634-2:2012 (D) 5 3.2.10 Natriumhydroxid, CAS 1310-
31、73-2. 3.2.11 Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), CAS 7-86-1. 3.2.12 Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch, 24 Volumenteile Chloroform (3.2.1) werden mit einem Volumenteil Isoamylalkohol (3.2.6) gemischt. ANMERKUNG hnliche, im Handel erhltliche Gemische drfen verwendet werden. 3.2.13 CTAB-Extraktions
32、pufferlsung, die CTAB (Massekonzentration = 20 g/l), Natriumchlorid (Stoff-mengenkonzentration c = 1,4 mol/l), TRIS (c = 0,1 mol/l) und NA2EDTA (c = 0,02 mol/l) enthlt. Der pH-Wert muss durch Zugabe von Salzsure auf 8,0 eingestellt werden. 3.2.14 Proteinase-K-Lsung, ( = 20 mg/ml). ANMERKUNG Aufbewah
33、rung nach dem Lsen in Form von kleinen Aliquoten bei 20 C. Nicht autoklavieren. 3.2.15 TE-Pufferlsung, die TRIS (c = 0,001 mol/l) und NA2EDTA (c = 0,000 1 mol/l) enthlt. Der pH-Wert muss durch Zugabe von Salzsure oder Natriumhydroxidlsung auf 8,0 eingestellt werden. 3.3 DNA-Reinigung mittels Festpha
34、senextraktion Fr die DNA-Reinigung knnen verschiedene Verfahren angewendet werden. ANMERKUNG Es sind unterschiedliche Formate im Handel erhltlich, darunter Spin-Filter-Sulchen bzw. -Platten. Geeignete, handelsbliche Kits knnen verwendet werden. 3.4 Reagenzien fr die Real-time-PCR 3.4.1 Konzentrierte
35、 PCR-Pufferlsung1)(enthlt Reaktionspuffer, dNTPs, MgCl2und Hotstart-Taq-Poly-merase). 3.4.2 Oligonukleotide, jeweils c = 20 mol/l. 3.4.2.1 Allgemeines Bezglich Informationen zur DNA-Zielsequenz und Validierung der Selektivitt siehe 6.3. ANMERKUNG Beim Ringversuch erhielten die Teilnehmer ihre Primer
36、- und die Sondenlsung aus dem gleichen Herstellungslos. 3.4.2.2 Forward primer (iF) Cel-MDH iF 5-CgA TgA gCg TgT ACT gAg TC 3. 3.4.2.3 Reverse primer (iR) Cel-MDH iR 5-AAT Agg AAC TAA CAT TAA TCA TAC CAA AC 3. 3.4.2.4 Cel-MDH probe (Sonde) 5-FAM-AAC AgA TAA CgC TgA CTC ATC ACA CCg-TAMRA 3 2). 1) Fr
37、die PCR-Pufferlsung knnen gebrauchsfertige Gemische oder Einzelsubstanzen verwendet werden, solange sie mit den fr den Ringversuch angegebenen Ergebnissen vergleichbar oder besser als diese sind. 2) FAM: 6-Carboxyfluorescein, TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamin; gleichwertige Reporter- und/oder Quen
38、cher-farbstoffe knnen verwendet werden, wenn gezeigt wird, dass sie zu vergleichbaren oder besseren Ergebnissen fhren. DIN CEN/TS 15634-2 (DIN SPEC 10701-1):2012-04 CEN/TS 15634-2:2012 (D) 6 4 Gerte und Ausrstungen 4.1 Allgemeines Die allgemeinen Aspekte sind in EN 15634-1 3 beschrieben. Zustzlich z
39、ur gewhnlichen Laborausrstung sind folgende Gerte und Ausrstungen notwendig. ANMERKUNG Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der PCR-Analytik und der daraus resultierenden Gefahr von DNA-Kontaminationen ist die Verwendung von aerosolgeschtzten Filterspitzen beim DNA-Extraktionsverfahren verbindlich. 4.
40、2 DNA-Extraktion 4.2.1 Geeignete Reaktionsgefe, Volumina von 1,5 ml und 2 ml, steril; sterile 50-ml-Zentrifugenrhrchen. 4.2.2 Thermostat oder Wasserbad, vorzugsweise mit Schttelfunktion. 4.2.3 Zentrifuge, die geeignet ist, 50-ml-Reaktionsgefe bei 8 000 g3)zu zentrifugieren. 4.2.4 Zentrifuge, die gee
41、ignet ist, 1,5-ml- und 2-ml-Reaktionsgefe bei 14 500 g zu zentrifugieren. 4.2.5 Gert und/oder Material zur Probenzerkleinerung, z. B. Kchenmixer. 4.2.6 UV-Spektralphotometer oder andere fr die DNA-Mengenabschtzung geeignete Nachweisgerte. 4.3 PCR 4.3.1 Geeignete PCR-Gefe. 4.3.2 Mikrozentrifuge fr PC
42、R-Gefe. 4.3.3 Real-time-PCR-Gert geeignet zu Anregung und Emissionsmessung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden. 5 Analysenschritte 5.1 Allgemeines Die allgemeinen Aspekte sind in EN 15634-1 3 beschrieben. 5.2 Probenvorbereitung Es sollte sichergestellt werden, dass die Untersuchungsprobe fr d
43、ie Laborprobe reprsentativ ist, z. B. durch Vermahlen bzw. Homogenisieren. Um das Risiko von Verschleppungskontaminationen zu vermeiden, sollte die gesamte Ausrstung vor dem bergang zur nchsten Probe grndlich gereinigt werden. Beispiele fr Reinigungsmittel oder Reinigungs-verfahren umfassen: DNA abb
44、auende Wirkstoffe, Hypochloritlsung, heies Wasser und chemische Reinigungsmittel. 3) g = 9,81 ms2. DIN CEN/TS 15634-2 (DIN SPEC 10701-1):2012-04 CEN/TS 15634-2:2012 (D) 7 5.3 Herstellung der Extrakte 5.3.1 DNA-Extraktion mit CTAB und DNA-Reinigung Parallel zu den Untersuchungsproben sollten die unte
45、r 5.4.6 und 5.4.7 aufgefhrten Kontrollen in geeignetem Umfang ausgefhrt werden. Jede Analyse sollte nach folgendem Protokoll doppelt durchgefhrt werden: 2 g der homogenisierten Probe in 50-ml-Zentrifugenrhrchen einwiegen (Rhrchen A); 10 ml CTAB-Puffer (3.2.13) zugeben; 30 l Proteinase-K-Lsung (3.2.1
46、4) zugeben und durch Inversion, Pipettieren oder Verwendung eines Laborschttelgertes mischen; 90 min bei 65 C inkubieren und dabei schtteln; 5 min bei Raumtemperatur und 6 000 g bis 8 000 g zentrifugieren; 500 l Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (3.2.12) in einem 2-ml-Reaktionsgef vorlegen (Rhr-chen
47、 B); 700 l berstand von Rhrchen A zu Rhrchen B hinzufgen und 30 s grndlich mischen; 15 min bei Raumtemperatur und etwa 14 500 g zentrifugieren; 500 l Isopropanol (3.2.7) in einem 1,5-ml-Reaktionsgef vorlegen (Rhrchen C); 500 l berstand (wssrige Phase) von Rhrchen B zu Rhrchen C hinzufgen und durch I
48、nversion, Pipettieren oder Verwendung eines Laborschttelgertes vorsichtig mischen; Rhrchen C 30 min bei Raumtemperatur inkubieren; 15 min bei Raumtemperatur und etwa 14 500 g zentrifugieren; berstand mit einer Pipette oder durch behutsames Ausgieen vorsichtig abziehen und verwerfen; 500 l Ethanol (3.2.2) in das Reaktionsgef geben und das Reaktionsgef mehrmals schwenken; 5 min bei Raumtemperatur und etwa 14 500 g zentrifugieren; berstand mit einer Pipette oder durch behutsames Ausgieen vorsichtig abziehen und verwerfen; extrahierte DNA zur Entfernung der verbliebenen Spuren
