1、Dezember 2008 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 65.120!$K36“1401619www.d
2、in.deDVornormDIN CEN/TS 15754Futtermittel Bestimmung des Zuckergehalts Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographieverfahren(HPAEC-PAD);Deutsche Fassung CEN/TS 15754:2008Animal feeding stuffs Determination of sugar content High performance exchange chromatographic method (HPAEC-PAD);German version
3、 CEN/TS 15754:2008Aliments des animaux Dtermination de la teneur en sucre Chromatographie dchange danions haute performance couple la dtection parampromtrie pulse (HPAEC-PAD);Version allemande CEN/TS 15754:2008Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 20
4、 SeitenDIN CEN/TS 15754:2008-12 2 Nationales Vorwort Die Mitarbeit des DIN beim Europischen Komitee fr Normung (CEN) wird fr den Bereich des CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) ber das nationale Spiegelgremium, den Arbeitsausschuss Futtermi
5、ttel“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. Eine Vornorm ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegebe
6、n wird. Zur vorliegenden Vornorm wurde kein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser Vornorm sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform a
7、n den Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. Fr die in diesem Dokument zitierten Internationalen Normen wird im Folgenden auf die entsprechenden Deutschen Normen hingewiesen: ISO 5725-2 siehe DI
8、N ISO 5725-2 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN ISO 5725-2, Genauigkeit (Richtigkeit und Przision) von Messverfahren und Messergebnissen Teil 2: Grundlegende Methode fr Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichprzision eines vereinheitlichten Mess-verfahrens Vornorm TECHNISCHE SPE
9、ZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 15754 September 2008 ICS 65.120 Deutsche Fassung Futtermittel Bestimmung des Zuckergehalts Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographieverfahren (HPAEC-PAD) Animal feeding stuffs Determination of sugar content High performance exchan
10、ge chromatographic method (HPAEC-PAD) Aliments des animaux Dtermination de la teneur en sucre Chromatographie dchange danions haute performance couple la dtection par ampromtrie pulse (HPAEC-PAD) Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 17. Mai 2008 als eine knftige Norm zur vorlufig
11、en Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind ve
12、rpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und die CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlungder CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitgliede
13、r sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich,Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal,Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Sloweni
14、en, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreichund Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2008 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form
15、und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. CEN/TS 15754:2008 DCEN/TS 15754:2008 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 Einleitung.3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Begriffe .4 4 Kurzbeschreibung .4 5 Reagenzien.4 6 Prfgerte.6 7 Probenahme
16、 .7 8 Vorbereitung des Prfmusters.7 9 Prfverfahren .7 10 Berechnung und Angabe der Ergebnisse.9 11 Przision 10 12 Prfbericht. 10 Anhang A (informativ) Ergebnisse eines Ringversuchs fr alle einzelnen Zuckerarten 11 Literaturhinweise . 18 DIN CEN/TS 15754:2008-12 Vornorm CEN/TS 15754:2008 (D) 3 Vorwor
17、t Dieses Dokument (CEN/TS 15754:2008) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/ode
18、r CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erarbeitet, das die Europische Kommission und die Europische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und untersttzt grundlegende Anforderungen der EG-Rich
19、tlinien. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Technische Spezifikation anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Lux
20、emburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. Einleitung Diese Technische Spezifikation beschreibt eine Anwendung der Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromato
21、-graphie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD), durch die in Trockenfutter die einzelnen unterschiedlichen Zuckerarten, sowohl Mono- als auch Disaccharide, zu bestimmen sind. Die HPAEC-PAD ist ein modernes Verfahren der Flssigkeitschromatographie mit besonders hoher Selektivi-tt und S
22、ensitivitt fr Kohlenhydrate. Durch diese fr Kohlenhydrate hohe Selektivitt und Sensitivitt der HPAEC-PAD muss bei den meisten Anwendungen fr Lebensmittel- und Futtermittelmatrizen nur ein mini-maler Aufwand fr die Probenreinigung betrieben werden. Die vorliegende Technische Spezifikation dient der E
23、infhrung eines neuen Verfahrens zur Bestimmung der individuellen Zuckergehalte in Tierfuttermitteln. Dieses Dokument sollte angewendet werden, um Erkenntnisse zu dieser neuen und sehr wirkungsvollen Technik und zum beschriebenen Verfahren zur quantitativen Bestimmung der individuellen Zuckerarten in
24、 Futtermitteln zu gewinnen. Gegenwrtig wird die Prfausrstung fr die HPAEC-PAD vorrangig fr Forschungszwecke angewendet und ist in Futtermittel- und Prflaboratorien noch nicht sehr weit verbreitet. Daher ist das Verfahren zum gegen-wrtigen Zeitpunkt fr Anwendungen zur offiziellen Kontrolle des Zucker
25、gehalts in Futtermitteln noch nicht geeignet. Es ist jedoch zu erwarten, dass in den nchsten Jahren in immer mehr Laboratorien die ent-sprechenden Prfgerte verfgbar sein werden. DIN CEN/TS 15754:2008-12 Vornorm CEN/TS 15754:2008 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation beschreibt die
26、 quantitative Bestimmung spezifischer Zucker (Glucose, Fructose, Galactose, Saccharose, Maltose und Lactose) in Trockenfutter im Bereich Gramm/Kilogramm (g/kg) mit Hilfe der verfeinerten Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie in Verbindung mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD)
27、. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Ver-weisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen
28、). EN ISO 3696, Wasser fr analytische Laborzwecke Spezifikation und Prfverfahren (ISO 3696:1987) ISO 6498, Animal feeding stuffs Preparation of test samples 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt folgender Begriff. 3.1 Gesamtzuckergehalt Summe des Gehalts der einzelnen Zucker Glucose, Fru
29、ctose, Galactose, Maltose, Saccharose und Lactose in der Probe, alle angegeben in Gramm/Kilogramm (g/kg) 4 Kurzbeschreibung Die Zuckerarten, die in der Prfmenge der Futtermittelprobe vorhanden sind, werden mit Wasser extrahiert. Die Reinigung des wssrigen Extrakts erfolgt entweder nach einem SPE-Ver
30、fahren ber eine C-18-Sule oder durch eine Deproteinisierung (Enteiweiung) mit Acetonitril. Nach dem Reinigen wird die Probenlsung verdnnt, und die vorhandenen Zucker werden durch Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie getrennt und durch gepulste amperometrische Detektion nachgewiesen. Die me
31、ngenmige Erfassung der vorhandenen Zucker erfolgt durch Vergleich der Peakflchen und/oder -hhen mit denen einer extern mit Standardlsungen erstellten Kalibrierkurve. 5 Reagenzien Sofern nicht anders festgelegt, sind nur Reagenzien in anerkannter analytischer Reinheit anzuwenden. 5.1 Wasser, der EN I
32、SO 3696, Grad 3 entsprechend. 5.2 Acetonitril 5.3 Dimethylsulfoxid (DMSO) 5.4 Natriumhydroxid, Massenanteil, w(NaOH) = 50 % in Wasser Das Reagens sollte die Mindestmenge Carbonat und Quecksilber enthalten. Die Lsung darf vor Gebrauch weder geschttelt noch gerhrt werden. DIN CEN/TS 15754:2008-12 Vorn
33、orm CEN/TS 15754:2008 (D) 5 5.5 Natriumacetat-Trihydrat (CH3COONa 3H2O) 5.6 Eluent 1 (E1), wssrige Lsung mit 500 mmol/l Natriumhydroxid (NaOH) Einem 1 000-ml-Messkolben sind etwa 800 ml entgastes Wasser (Eluent 3, 5.8) und danach 40,0 g Natrium-hydroxid mit 50 % (m/m) (5.4) hinzuzufgen. Die wssrige
34、Lsung ist bis zur Marke mit entgastem, ent-mineralisiertem Wasser (5.8) zu verdnnen. 5.7 Eluent 2 (E2), wssrige Lsung mit 500 mmol/l Natriumacetat Einem 1 000-ml-Messkolben sind etwa 800 ml entgastes, entmineralisiertes Wasser (Eluent 3, 5.8) und anschlieend 68,0 g Natriumacetat-Trihydrat (CH3COONa
35、3H2O) (5.5) hinzuzufgen. Die wssrige Lsung ist bis zur Marke mit entgastem, entmineralisiertem Wasser (5.8) zu verdnnen. 5.8 Eluent 3 (E3), entgastes, entmineralisiertes Wasser Das entmineralisierte Wasser ist durch ein 0,2-Membranfilteren zu filtrieren. Die Entgasung erfolgt, indem mindestens 30 mi
36、n mit Helium gesplt wird (Durchperlen von Helium). 5.9 Zucker-Standardlsungen 5.9.1 Herstellung der Stammlsung Es sind tglich frische wssrige Lsungen von Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Saccharose und Lactose herzustellen. Etwa 40 mg jedes Zuckers sind auf 0,1 mg in jeweils einen 100-ml-Messk
37、olben (6.6) einzuwgen und bis zur Marke mit Wasser zu verdnnen (Standard-Stammlsungen mit 400 mg/l). ANMERKUNG 1 Die Misch-Standardlsungen knnen auch auf einmal angesetzt werden, sobald die Retentionszeit der einzelnen Zuckerarten unter den jeweils vorliegenden chromatographischen Bedingungen bekann
38、t ist. ANMERKUNG 2 Die Standardlsungen knnen weiter verdnnt werden, um Zuckerkonzentrationen zu erreichen, die mit den in den Probenlsungen gefundenen Konzentrationen vergleichbar sind. 5.9.2 Arbeits-Standardlsungen fr die Kalibrierung Von den Zucker-Standardlsungen sind Verdnnungen nach Tabelle 1 h
39、erzustellen. 0,25 ml jeder erhaltenen Standardlsung sind mit 1,25 ml DMSO in einem HPLC-Probenflschchen zu verdnnen. Das Proben-flschchen ist zu verschlieen und grndlich zu schtteln. Tabelle 1 Herstellung wssriger DMSO-Kohlenhydrat-Standardlsungen Kalibrier-Standardlsung Volumen der Zucker-Standard-
40、Stammlsung ml Wasser-volumen ml Zuckerkonzentration nach Verdnnen mit DMSO g/mlaStandardlsung 1 0,00 10,00 0 Standardlsung 2 0,10 9,90 0,67 Standardlsung 3 0,30 9,70 2,00 Standardlsung 4 0,70 9,30 4,67 Standardlsung 5 1,40 8,60 9,33 Standardlsung 6 2,00 8,00 13,33 aBasierend auf einem Zuckergehalt v
41、on genau 400 mg/l in der wssrigen Stammlsung. DIN CEN/TS 15754:2008-12 Vornorm CEN/TS 15754:2008 (D) 6 Diese wssrigen DMSO-Zucker-Standardlsungen werden zum Erstellen der Kalibrierkurven verwendet. ANMERKUNG Wssriges DMSO ist ein gutes Lsemittel fr Kohlenhydrate und verhindert eine mikrobielle Beein
42、trch-tigung der Kohlenhydrate in den Lsungen. 6 Prfgerte bliche Laborgerte und insbesondere Folgendes. 6.1 Analysenwaage, mit der auf 0,1 mg gewogen werden kann. 6.2 Zentrifugierrhrchen aus Glas, mit Fassungsvermgen von 50 ml. 6.3 Homogenisiergert.1)6.4 Zentrifuge mit Ausschwingrotor, auf eine Zentr
43、ifugalkraft von etwa 2 800 g eingestellt. 6.5 Zentrifugierrhrchen, mit Schraubkappen mit einer Einlage aus Polytetrafluorethylen (PTFE), Fassungsvermgen etwa 10 ml. 6.6 Messkolben mit Marke, mit Fassungsvermgen von 100 ml und 1 000 ml. 6.7 Dispenser, die gegen organische Lsemittel bestndig und auf 2
44、,5 ml und 20 ml eingestellt sind. 6.8 SPE-C-18-Einweg-Kartuschen, anzuwenden nach den Empfehlungen des Herstellers. 6.9 Metallfreies Flssigkeits-Chromatographie-System2), anwendbar fr ein ternres Gradienten-Elutionsprofil. 6.10 Sulen-Ofen, eingestellt auf 30 C. 6.11 Hochleistungs-Anionenaustauschers
45、ule3), gefllt mit Pellikularpolystyrol-Divinylbenzol-Harz und mit einer Vorsule4)(Schutzsule), aufgestellt im Sulen-Ofen (6.10). 6.12 Gepulster amperometrischer Detektor5)mit Gold-Elektrode, der zusammen mit den Sulen im Sulen-Ofen bei 30 C (6.10) angeordnet wird. Folgende Detektoreinstellungen werd
46、en angewendet: 0 s bis 0,40 s Potenzial-Arbeitselektrode +0,1 V; 0,41 s bis 0,60 s Potenzial-Arbeitselektrode +0,7 V; 0,61 s bis 1,00 s Potenzial-Arbeitselektrode 0,1 V; Integrationsfenster 0,20 s bis 0,40 s. 6.13 Integrator fr das Chromatographie-Datensystem. 1) Ein IKA Ultra-Turrax ist ein Beispie
47、l fr ein geeignetes, handelsbliches Homogenisiergert. 2) Der Modul Dionex-ICS-3000 ist ein Beispiel fr ein geeignetes, handelsbliches metallfreies Chromatographie-System mit einer quaternren Gradienten-Elutionspumpe. 3) Die analytische Sule Dionex-Carbopac-PA1 (4 250 mm) ist ein Beispiel fr eine gee
48、ignete, handelsbliche Hoch-leistungs-Anionenaustauschersule. 4) Die Schutzsule Dionex-Carbopac-PA1 (4 50 mm) ist ein Beispiel fr eine geeignete, handelsbliche Schutzsule. 5) Das Modell Dionex-PAD-II ist ein Beispiel fr einen geeigneten, handelsblichen amperometrischen Detektor. DIN CEN/TS 15754:2008-12 Vornorm CEN/TS 15754:2008 (D) 7 7 Probenahme Es ist wichtig, dass das Laboratorium eine Probe erhlt, die tatschlich reprsentativ ist und bei Transport und/oder Lagerung nicht beschdigt oder verndert worden ist. Die Probenahme ist nicht Teil des in dieser Technisch
