1、September 2011 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.120.30Zur Erstellu
2、ng einer DIN SPEC knnen verschiedene Verfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$lpo“1737776www.din.deDDIN CEN/TS 16233-1Lebensmittel HPLC-Verfahren zur Bestimmung von Xanthophyllen in Fischfleisch Teil 1: Bestimmung von Ast
3、axanthin und Canthaxanthin;Deutsche Fassung CEN/TS 16233-1:2011Foodstuffs HPLC method for the determination of xanthophylls in fish flesh Part 1: Determination of astaxanthin and canthaxanthin;German version CEN/TS 16233-1:2011Produits alimentaires Mthode de dosage des xanthophylles dans la chair de
4、 poisson par CLHP Partie 1: Dosage de lastaxanthine et de la canthaxantine;Version allemande CEN/TS 16233-1:2011Alleinverkauf der Spezifikationen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 18 SeitenDIN SPEC 91050-1DIN CEN/TS 16233-1 (DIN SPEC 91050-1):2011-09 Nationales Vorwort D
5、ieses Dokument (CEN/TS 16233-1:2011) wurde vom CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ (Sekretariat DIN, Deutschland) erarbeitet. Der national zustndige Arbeitsausschuss ist der NA 057-01-13 AA Vitamine und Carotinoide“ im Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte
6、(NAL)“. Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Zur vorliegenden DIN SPEC wurde kein Entwurf verff
7、entlicht. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftlic
8、he Produkte (NAL) im DIN, 10772 Berlin (Hausanschrift: Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin). 2 TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 16233-1 Juli 2011 ICS 67.120.30 Deutsche Fassung Lebensmittel HPLC-Verfahren fr die Bestimmung von Xanthophyllen in Fischfleisch T
9、eil 1: Bestimmung von Astaxanthin und Canthaxanthin Foodstuffs HPLC method for the determination of xanthophylls in fish flesh Part 1: Determination of astaxanthin and canthaxanthin Produits alimentaires Mthode de dosage des xanthophylles dans la chair de poisson par CLHP Partie 1: Dosage de lastaxa
10、nthine et de la canthaxantine Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 28. Mai 2011 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungn
11、ahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und die CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nat
12、ionale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien,
13、 Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZAT
14、ION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2011 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. CEN/TS 16233-1:2011 DCEN/TS 16233-1:2011 (D) 2 Inhalt Seit
15、e Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Chemikalien5 5 Gerte6 6 Kalibrierung7 7 Durchfhrung.8 8 HPLC .9 9 Berechnung10 10 Untersuchungsbericht 11 Anhang A (informativ) Validierung fr Astaxanthin.12 Anhang B (informativ) Typische Chromatogramme 14 Literatu
16、rhinweise 16 DIN CEN/TS 16233-1 (DIN SPEC 91050-1):2011-09 CEN/TS 16233-1:2011 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 16233-1:2011) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hin
17、gewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalte
18、n, diesen anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechis
19、che Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN CEN/TS 16233-1 (DIN SPEC 91050-1):2011-09 CEN/TS 16233-1:2011 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation legt ein Verfahren zur Bestimmung von Canthaxanthin und Astaxanthin in Fischfleisch mit Hochleistungsflssigchromatographi
20、e (HPLC) fest. Das Verfahren kann bei Gehalten von mehr als 0,02 mg/kg angewendet werden. Das Verfahren sollte nicht zur Bestimmung von Canthaxanthin in Geflgelfleisch, Eigelb und Garnelenfleisch angewendet werden, weil Canthaxanthin mit Cryptoxanthin und Xanthophyllestern, die in diesen Matrices zu
21、weilen vorliegen, interferieren kann. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokum
22、ents (einschlielich aller nderungen). EN ISO 3696:1995, Wasser fr analytische Laborzwecke Spezifikation und Prfverfahren (ISO 3696:1987) 3 Kurzbeschreibung Fischfleisch wird durch Homogenisieren des Gewebes in Aceton extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und unter vermindertem Druck mit einem Rotat
23、ionsverdampfer oder unter einem Stickstoffstrom bei 50 C verdampft. Der Rckstand wird in einer Mischung aus n-Heptan und Aceton gelst und mit isokratischer Normalphasen-HPLC analysiert. Das beschriebene HPLC-System trennt wirksam Astaxanthin und Canthaxanthin sowie diese beiden Xanthophylle von ande
24、ren Carotinoiden, die in Fischfleisch vorkommen, wie z. B. -Carotin, Lutein und Zeaxanthin. Die wichtigsten geometrischen Isomere von Astaxanthin werden voneinander und von Oxidationsprodukten von Astaxanthin, Astacin und Semiastacin, getrennt. Im Gegensatz dazu werden die Isomere von Canthaxanthin
25、nicht getrennt. Bild 1 (all-E)-Astaxanthin Bild 2 (all-E)-Canthaxanthin DIN CEN/TS 16233-1 (DIN SPEC 91050-1):2011-09 CEN/TS 16233-1:2011 (D) 5 4 Chemikalien Falls nicht anders angegeben, werden bei der Analyse nur Wasser der Qualitt 1 nach EN ISO 3696:1995 und Chemikalien von anerkannter Analysenre
26、inheit, z. B. zur Analyse (p. a.), verwendet. 4.1 Magnesiumsulfat, wasserfrei, Reinheit (komplexometrisch): 98 % 4.2 Phosphorsure, der Volumenanteil betrgt 85 %, Reinheit (acidimetrisch): 85 % 4.3 Butylhydroxytoluol (BHT), Reinheit (GC): 99 % 4.4 Tetrahydrofuran, Reinheit (GC): 99 %, stabilisiert mi
27、t 0,025 % 2,6-Di-tert-butyl-p-kresol (BHT) 4.5 Cyclohexan, Reinheit (GC): 99 % 4.6 n-Heptan, Reinheit (GC): 99 % 4.7 Aceton, Reinheit (GC): 99 % 4.8 Ethanol, absolut, Reinheit (GC): 99 % 4.9 Methanol, Reinheit (GC) 99 % 4.10 Referenzsubstanzen von (all-E)-Astaxanthin und (all-E)-Canthaxanthin, Reinh
28、eit (HPLC): 95 % Die Referenzsubstanzen werden bei etwa 20 C unter Stickstoff oder Argon aufbewahrt. Spuren von Sauerstoff zerstren die Substanzen. 4.11 Mobile Phase fr die HPLC, Lsemittel, isokratisch 86 Volumenteile n-Heptan (4.6) werden mit 14 Volumenteilen Aceton (4.7) gemischt. 4.12 Herstellung
29、 der Astaxanthin-Standardlsung, = 1,5 mg/ml Etwa 1,5 mg der Referenzsubstanz von (all-E)-Astaxanthin (4.10) werden auf 0,1 mg in einen 100-ml-Mess-kolben eingewogen, und es wird 1 g BHT (4.3) zugegeben. Beide Substanzen werden in 5 ml Tetrahydrofuran (4.4) gelst und der Kolben wird bis zur Marke mit
30、 Tetrahydrofuran aufgefllt. Die Auflsung wird durch Behandlung mit Ultraschall untersttzt. Ein aliquoter Anteil dieser Lsung von 10 ml wird in einen 100-ml-Messkolben berfhrt und etwa 85 ml n-Heptan (4.6) werden hinzugefgt. Die Mischung khlt ab und zieht sich zusammen“ (das Volumen verringert sich).
31、 Die Lsung wird auf Raumtemperatur erwrmt und der Kolben bis zur Marke mit n-Heptan aufgefllt. Das ergibt eine Astaxanthin-Konzentration von etwa 1,5 mg/l in einer Mischung aus 9 Volumenteilen n-Heptan und einem Volumenteil Tetrahydrofuran. 4.13 Herstellung der Canthaxanthin-Standardlsung, = 1,5 mg/
32、ml Etwa 1,5 mg der Referenzsubstanz von (all-E)-Canthaxanthin (4.10) werden auf 0,1 mg in einen 100-ml-Messkolben eingewogen, und es wird 1 g BHT (4.3) zugegeben. Beide Substanzen werden in 5 ml Tetrahydrofuran (4.4) gelst und der Kolben wird bis zur Marke mit Tetrahydrofuran aufgefllt. Die Auflsung
33、 wird durch Behandlung mit Ultraschall untersttzt. Ein aliquoter Anteil dieser Lsung von 10 ml wird in einen 100-ml-Messkolben berfhrt und etwa 85 ml Cyclohexan (4.5) werden hinzugefgt. Die Mischung khlt ab und zieht sich zusammen“ (das Volumen verringert sich). Die Lsung wird auf Raumtemperatur erw
34、rmt und der Kolben bis zur Marke mit Cyclohexan aufgefllt. Das ergibt eine Canthaxanthin-Konzentration von etwa 1,5 mg/l in einer Mischung aus 9 Volumenteilen Cyclohexan und einem Volumenteil Tetrahydrofuran. DIN CEN/TS 16233-1 (DIN SPEC 91050-1):2011-09 CEN/TS 16233-1:2011 (D) 6 4.14 Herstellung ei
35、ner Lsung von hitze-isomerisierten Carotinoiden (Kontrolllsung). Etwa 1,5 mg (all-E)-Astaxanthin (4.10), 1,5 mg (all-E)-Canthaxanthin (4.10) und 0,5 g BHT (4.3) werden auf 0,1 mg gewogen und in einem 500-ml-Messkolben in 10 ml Tetrahydrofuran (4.4) gelst. Diese Lsung ist mit 200 ml einer Mischung au
36、s 86 Volumenteilen n-Heptan (4.6) und 14 Volumenteilen Aceton (4.7) zu verdnnen. Die Mischung wird 1 h in einem Wasserbad bei 80 C unter Rckfluss erhitzt. Nach dem Abkhlen auf Raumtemperatur wird die Lsung bis zur Marke mit der Mischung aus n-Heptan und Aceton verdnnt. Die Mischung wird in eine Vorr
37、atsflasche gegossen, gut gemischt, ber Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschlieend in eine Vielzahl von HPLC-Flschchen verteilt. Die Flschchen werden unverzglich sorgfltig mit Septa aus Polytetrafluorethylen (PTFE) und Silicon verschlossen und bei einer Temperatur von etwa 23 C im Dunke
38、ln aufbewahrt. 5 Gerte bliche Laborgerte, Glasgerte und die Folgenden. 5.1 Messermhle, geeignet fr Lebensmittel, mit einem Mahlraumvolumen etwa 1 000 ml 5.2 Sinterglasfritte, Porositt 3 (16 m bis 40 m), Durchmesser: etwa 6 cm 5.3 Dispergiergert 5.3.1 Labor-Dispergiergert (Stativ-Dispergiergert) fr e
39、twa 1 ml bis 2 000 ml, z. B. mit einem Dispergier-Aggregat mit einem Durchmesser von 20 mm 5.3.2 Hand-Dispergiergert fr etwa 1 ml bis 250 ml, z. B. mit einem Dispergier-Aggregat mit einem Durchmesser von 12 mm 5.4 Rotationsverdampfer, z. B. 20 C bis 100 C 5.5 Verdampfer mit Stickstoffstrom, mit Heiz
40、block und Pipettenhalter 5.6 Spektrometer, Wellenlngenbereich 190 nm bis 900 nm, Wellenlngengenauigkeit: 1 nm 5.7 Zentrifuge, Labortischzentrifuge fr mindestens 2 500 g 5.8 Waagen 5.8.1 Waage mit einer Ablesbarkeit von 0,01 g, Przision (Standardabweichung) von 0,005 g, Wgebereich 2 100 g. 5.8.2 Waag
41、e mit einer Ablesbarkeit von 0,01 mg, Przision (Standardabweichung) von 0,015 mg, Wgebereich 205 g 5.9 (Verteiler-)Modul fr die Festphasenextraktion, Stahlnadeln (0,90 mm 55 mm), angebracht an den Ventilauslssen 5.10 SPE-Sulen, 25 ml Fassungsvermgen, Kunststoff, ausgestattet mit Bodenfritten mit ein
42、er Porengre von 10 m 5.11 Chromatographisches System fr die HPLC, mit Sulenthermostat und UV/VIS- oder Diodenarraydetektor DIN CEN/TS 16233-1 (DIN SPEC 91050-1):2011-09 CEN/TS 16233-1:2011 (D) 7 6 Kalibrierung 6.1 Allgemeines Die Standardlsungen werden bei nur einer Konzentration hergestellt (4.12 u
43、nd 4.13), unmittelbar nach der Herstellung spektralphotometrisch gemessen (6.2), und anschlieend werden die Standardlsungen in das HPLC-System injiziert (6.3). Die Responsefaktoren der Carotinoide werden aus den Gesamtpeakflchen der Chromatogramme und den spektralphotometrisch ermittelten Konzentrat
44、ionen bestimmt. Da das Verfahren eine Ein-Punkt-Kalibrierung einschliet, wird empfohlen, die Linearitt des HPLC-Systems nach der Anwendung oder jeder Vernderung des Systems zu berprfen. Zu diesem Zweck knnen die Standardlsungen mit einer Mischung aus 86 Volumenteilen n-Heptan (4.6) und 14 Volumentei
45、len Aceton (4.7) verdnnt werden. Der Korrelationskoeffizient der Regressionsgeraden (die durch Null geht) sollte mehr als 0,98 betragen. 6.2 Spektralphotometrische Bestimmung der Konzentration der Standardlsung Innerhalb von 1 h nach der Herstellung wird die Konzentration von (all-E)-Astaxanthin bzw
46、. (all-E)-Canthaxanthin spektralphotometrisch bei dem entsprechenden Absorptionsmaximum gegen n-Heptan (4.6) gemessen. Die Massenkonzentration () der Standardlsung, in Milligramm je Milliliter, wird nach den Gleichungen (1) und (2) berechnet: 100200010maxnAstaxanthi)(all=AE (1) Dabei ist Amaxder Wer
47、t der Extinktion beim Absorptionsmaximum; 10 000 der Skalierungsfaktor; 2 100 der -Wert fr (all-E)-Astaxanthin. Der -Wert ist die theoretische Absorption einer 1%igen Lsung von (all-E)-Astaxanthin in n-Heptan in einer 1-cm-Kvette bei etwa 470 nm (max), siehe 1. %1cm1E%1cm1E200200010maxhinCanthaxant)
48、(all=AE (2) Dabei ist Amaxder Extinktionswert beim Absorptionsmaximum; 10 000 der Skalierungsfaktor; 2 200 der -Wert fr (all-E)-Canthaxanthin. Der -Wert ist die theoretische Absorption einer 1%igen Lsung von (all-E)-Canthaxanthin in Cyclohexan in einer 1-cm-Kvette bei etwa 466 nm (max), siehe 2. %1c
49、m1E%1cm1E6.3 Bestimmung des Responsefaktors der Standardlsung mit HPLC Innerhalb von 3 h nach der Herstellung werden mindestens sechs aliquote Anteile von jeweils 20 l jeder Standardlsung in das HPLC-System injiziert. Die Gesamtpeakflchen der Chromatogramme (einschlielich der Peaks des (all-E)-Isomers, mglicherweise vorliegender Z-Isomere und Verunr
