1、YY/T 0127.10-2001前言本标准主要依据GB 15193.4-1994食品安全性毒理学评价程序和方法以及GB 7919-1987化妆品安全性评价程序和方法而制定。本标准废除并代替YY 91042-1999牙科复合树脂充填材料附录A A3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)。本标准与前版标准在主要技术内容上无差别，仅对操作步骤操作予以细化，并进行了编辑性修改。本标准为YY 0268-1995口腔材料生物学评价第1单元:口腔材料生物性能评价导则提供了具体的试验方法。本标准从实施之日起，同时代替YY 91042-1999牙科复合树脂充填材料附录A A3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验
2、(Ames试验)。本标准的附录A是标准的附录。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。本标准由国家药品监督管理局北医医疗器械质量监督检验中心负责起草。本标准主要起草人:林红、刘文一、李盛琳。中华人民共和国医药行业标准口腔材料生物学评价第2单元:口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)YY/T 0127.10-2001代替YY 91042-1999附录AA3Biological evaluation of dental materials-Part 2: Biological evaluation test method of
3、dental materials-Salmonella typhimurium reverse mutation assay(Ames mutagenicity test)1范围本标准规定了口腔材料鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验方法。本试验用于测定可引起沙门氏杆菌基因置换和/或移码突变的口腔材料所诱发的依赖于组氨酸(his-)的菌株产生不依赖于组氨酸(his +)的基因突变。为检测口腔材料的诱变性试验之一。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB 7919-
4、1987化妆品安全性评价程序和方法GB 15193.4-1994食品安全性毒理学评价程序和方法YY/T 0127.2-1993口腔材料生物试验方法:静脉注射急性全身毒性试验ISO 7405-1997牙科学用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价牙科材料试验方法3仪器3.1实验室常用设备3.2洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，低温高速离心机，低温冰箱(-80C)或液氮罐等。4培养基和试剂的制备培养基和试剂的制备见附录A,5菌株准备、鉴定和贮藏5.1菌株采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌共四株TA97,TA98,TA100,TA102,5.2菌株贮存菌株贮存在加有二甲基亚矾的(光谱纯)新鲜细菌培养液
5、中，其体积比为0.09:1,混合后分装于小国家药品监督普理局2001一03-12批准2001一08一01实施YY/T 0127.10-2001试管或菌种管内，经干冰丙酮液(-75C)或液氮(一196C)速冻，在一80冰箱或一196C液氮中长期贮存。5. 3增菌培养从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5 mL营养肉汤培养基中，经37振荡(100次/min)培养10-12 h，活菌数应达10个/mL(或OD,oo、 0.4)。细菌培养液从37取出后，应立即放人冰浴中备用。试验需用当天孵育好的新鲜细菌。5.4菌株鉴定5.4.1组氨酸需求(his一)试验凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长
6、，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。鉴定方法:在底层培养基平皿表面加人0. 5 m mol/L L一组氨酸0. 1 mL和0. 5 m mol/L D一生物素。1 mL。用L棒铺开。对照平皿只加生物素不加组氛酸。用白金耳浸细菌培养液，在对照平皿和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上，经370C孵育24 h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生长，在对照平皿上不应生长。5.4.2 IN多搪屏障缺陷鉴定(rfa突变)粗糙型突变的微生物.其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进入菌体内而抑制其生长。野生型菌株或含gal缺失的菌株则不受
7、影响。鉴定方法:分别将每种细菌培养液0. 1 mL加到450C 2 mL顶层培养基试管内，混匀后倾倒于营养琼脂培养基平皿表面，使其均匀分布。待固化后，取直径为6 mm无菌滤纸圆片浸1 mg/mL结晶紫溶液10 pL，放到平皿中央。经37C孵育24 h后，围绕圆纸片出现透明的抑菌环(直径大约14 mm)，说明此菌存在深粗型(rfa)突变。TA 97,TA 98,TA 100,TA 102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。5.4.3对萦外线敏感性鉴定(uvrB修复缺陷型的鉴定)具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法:用白金耳浸细菌培养
8、液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线.四株细菌可划在同一平皿上。用黑纸彼盖平皿一半，在距离33 cm处用15 w紫外线杀菌灯照射平皿8s,经37C孵育24 h后观察结果。对紫外线敏感的菌株(TA 97,TA 98,TA 100)只在未照射过的一半平皿上生长。而具有uvrB修复缺陷型的菌株(TA 102)在紫外线照射(未盖黑纸的另一半平皿)后仍能生长。5.4.4抗氨节青霉素(PKM101)试验(菌株R因子丢失鉴定)含R因子的试验菌株对氨节青霉素具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性，故需鉴定R因子是否存在。鉴定方法1:用白金耳浸细菌培养液，在含氨节青霉素平皿表面平行划线，
9、四株细菌可划在同一平皿上。还应选用一个无抗性因子的菌株，以测定氨节青霉素的效应。经37V孵育24 h后，无抗性因子菌株不应生长。鉴定方法2:用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。将沾有氨节青霉素溶液的滤纸条与划线文叉放里,370C孵育24 h。如滤纸条周围细菌生长正常，说明试验菌株具有R因子。5.4.5四环素(PAQI )抗性的鉴定鉴定方法1:用白金耳浸细菌培养液，在含氨节青霉素/四环素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。经37C孵育24 h后，对四环素有抗性的TA 102菌株能生长，对四环素无抗性的菌株不生长。鉴定方法2:用白金耳浸细菌培养
10、液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。待干后，吸取四环素(8 mg/mL)溶液与菌株划线处交叉划线，37 C孵育24 h。对四环素有抗性的TA 102菌株能生长，其他菌株不生长。YY/T 012710-20015.4.6自发回变数(his十)的测定在小试管中加人融化的顶层培养基2 mL，分别加人待测菌株的菌液0. 1 mL，迅速在高速液体混合器上混匀，倾倒在已固化的底层培养基平皿上，使其均匀分布待固化后，经37C孵育48 h，计数全部菌落数。一个菌株应做2-3个平皿，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值在一个恒定的范围。各试验菌株的自发回变数分别为
11、:TA97 (97180) ; TA98 (15-60) ;TA100(75-200) ;TA 102 (240-360 )。加过S-9的菌株，自发回变数稍有增加。5.4.7对阳性突变剂的敏感性鉴定使用已知阳性对照剂，检查试验菌株的敏感性是否降低，其方法同7,6代谢活化剂仁大鼠肝微粒体酶(S-9)的诱导和制备6.1大鼠肝微粒体酶(S-9)的诱导选用体重150200 g的健康雄性S。大白鼠或体重110150 g的Wistar大鼠。将多抓联苯(Aro-clor 1254或国产PCB一五抓)溶于玉米油中，浓度为200 mg/mL，腹腔一次注射500 mg/kg(体重)。第6天用颈动脉排空血液法处死，
12、处死前12h禁食不禁水。6.2切取肝脏处死的大鼠经过无菌处理，打开腹腔，用20 mL 0. 15 mol/L抓化钾溶液(4 0C)进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出，整个过程应在无菌室中进行。离体以后的肝脏始终保持4C以下无菌操作。6.3 S-9的制备制备S-9的一切器皿均应消毒，全部操作在冰水浴中进行.肝脏称重后，在0. 15 mol/L抓化钾溶液中洗涤数遍。每克重肝脏加。15 mol/L抓化钾溶液3 mL,用剪刀剪碎肝脏，放人组织匀浆机中，以4 000 r/min匀浆2 min。将匀浆液放人低温(0 -4 C)高速离心机上，以9 000 g离心10 min，其上层液即S-9,6.
13、4 S-9贮存吸取2 mL上层液分装于小试管或安瓶中。在密封的条件下，用干冰丙酮液速冻后，贮存于一80C冰箱或掖氮容器中。保存期不超过一年。6.5S-9鉴定S-9制备后，应进行下列侧定:a)无菌检查;h)蛋白含量测定(Lowry法);每毫升蛋白含量应不超过40 mg,c)细胞色素P-450测定;S-9活力还必须以标准致癌物进行测定。6.65一9的剂量选择首先使用标准浓度的S-9混合液，测定其对已知阳性致癌物的生物活性，确定最适用量。如果是阴性结果，还应使用高浓度的S-9混合液重新试验。6.7 S-9混合液制备:见附录A A8,7受试样品的制备试样制备可选用生理盐水、二甲基亚讽(DMSO)或其他
14、溶剂(毒性剂量以下)，无论选用何种溶剂，均应无诱变性。将材料制备成溶液、混悬液或浸提液。浸提液制备按YY/T 0127.2规定的方法进行。了.1受试样品剂量选择预试验用菌株TA100进行预试验(操作程序应与正式试验一致)，以了解受试样品对细菌的毒性。YY/T 0127.10-2001决定受试样品的最高剂量的标准是细胞毒性和溶解度。细胞毒性表现是:平皿中回复突变菌落数减少;背景菌苔变清晰;40倍显微镜下背景菌苔稀疏，体积增大等。毒性大的受试样品，选择有轻微毒性的剂量作为试验的最高剂量。毒性小、溶解度高的受试样品，最高剂量溶液50 mg/ml-混悬液100 mg/mL，浸提液200 mg/mL.每
15、种受试样品至少设五个剂量。8诱变试验方法一次试验最少设5个剂量组及阴性(溶媒)对照组和阳性对照组，代谢活化和非代谢活化两种测试过程应同时进行。试验结果在有背景菌苔存在情况下，计算每个平皿的回变菌落数，并需重复试验1-2次。8门预培养法分别取。1 mL受试样品液、0. 5 mL S-9混合液(需代谢活化时加。不需代谢活化时加。. 5 mL不含S-9的磷酸缓冲液),0. 1 mL细菌培养液。将三者移人无菌小试管内混合，在37 C振荡培养20 min,再加人2 mI_顶层培养基，混匀后倾倒在底层培养基平皿上，使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转，经37 C孵育48 h观察结果。8.2平板掺人法将含。5
16、 m mol/L组氨酸生物素的顶层培养基2 mL分装于小试管中，45C恒温水浴中保温，每管再依次加人。1 mL受试样品液、0. 1 mL细菌培养液和0. 5 mL S-9混合液(需代谢活化时加。不需代谢活化时加0. 5 ml_不含S-9的磷酸缓冲液)，混匀后倾倒在底层培养基平皿上并使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转，经37C孵育48 h观察结果。9结果评定记录试验组和对照组的每一平皿的回变菌落数，每个试验组的回变菌落数以平均值和标准差(X士SD)表示。受试样品的回变菌落数高于阴性对照回变菌落数的二倍以上，并有剂量一效应关系或某一个或某几个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性反应，则判为诱变阳
17、性。YY/r 0127.10-2001附录A(标准的附录)培养基和试荆的制备A1顶层培养基琼脂氯化钠蒸馏水加热溶化后:.:200 mL，加人0. 5m mol/I组氨酸一生物素溶液20 mL. 121C 104 kPa 20 min高压灭菌。A2底层培养基琼脂7. 5 g蒸馏水465 mL121 C 104 kPa 20 min高压消毒后，趁热(80C)在其内依次加人50 X (V-B)培养基E 10 ml和40葡萄糖溶液25 mL,混匀，按每皿30 mL倒平皿，冷凝固化后倒置于37培养箱中24-48 haA3 Vogel-Bonner(V-B)培养基E(50x)硫酸镁(MgS047H,0)
18、25 g构椽酸(C,HaO?一H,O) 250 g磷酸氢二钾(K2HP0,) 1 250 g磷酸氢按钠(NaNH,HPO,4H,O) 437. 5 g加蒸馏水至100 mL先将后三种溶解后，再加人硫酸镁，待完全溶解后，分装于锥形瓶里，121V 104 kPa 20 min高压消A540%葡萄藕溶液称取40 g葡萄糖，加人蒸馏水至100 mL,115 C 69 kPa 20 min高压消毒。4C保存。营养肉汤培养基氰A42.555.05255105牛肉膏胰陈(或混合蛋白脏)氯化钠磷酸氢二钾蒸馏水加热溶解，调pH至7.4,121C 104 kPa 20 min500 mL高压消毒。4保存。A6营养
19、肉汤琼脂培养甚琼脂粉7. 5 g肉汤培养基500 mL加热溶化后，调pH至7. 4,121C 104 kPa 20 min高压消毒后，倒斜面或平皿。用于菌株鉴定、细菌活力鉴定或常规试验用菌株保存。YY/T 0127.10-2001A7 0. 5 m mol/L组氮酸一生物素溶液D一生物素(分子量247. 3)I.一组氨酸盐(分子量191.7)加蒸馏水至121C 104 kPa 20 min高压消毒。4C保存。30.9 mg24. 0 mg250 mLA8 S-9混合液配制(按每毫升S-9混合液计算)表Al标准浓度高浓度大鼠肝S-90.4 mol/L M解1,-1. 5 mol/L KCI盐溶液
20、0. 2 mol/L 6-磷酸葡萄糖0. 2 mol/L辅酶I0. 2 mol /L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)无菌蒸馏水混匀，里冰浴中待用40 ILL20 pL25 pL20 pL500 pL395 1l100 pL20 pL25 ILL20 pL500 AL335 plA9 MgC12-KCI盐溶液(1. 65 mol/L KCI+0.4 mol/L MgC12)抓化钾(KCI )氛化镁(MgC12蒸馏水加至121C 104 kPa6H,0)61.5 g40. 7 g500 mL20 min高压消毒A10 0.2 mol/L辅醉II(NADP)溶液NADP(分子量765.4) 459.24
21、 mg蒸馏水(无菌)3 mL无菌条件下配制，分装于EP管中，-20保存。All 0. 2 mol/L 6-磷酸葡萄铭(G-6-P)溶液G-6-P钠盐(分子量304.1) 182.46 mg蒸馏水(无菌)3 mL无菌条件下配制，分装于EP管中，-20保存。0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PH 7.4)磷酸二氢钠(NaH,PO,磷酸氢二钠(Na2HP0,121C 104 kPa 20 min2H,O)(28.4 g/I)12H20) (27, 6 g/L)高压消毒。4C保存。880 mL120 mL0.15 mot/L氮化钾溶液精确称取氮化钾11. 18 g，用蒸馏水稀释至1 000 mL,121C 104 kPa 30 min高压消毒，冷却后冰箱，用于S-9制备。AIAI保YY/T 0127.10-2001A14奴节青.素溶液(8 mg/mL)称取三轻氨青霉素80 mg，加人。.02 mol/L氢氧化钠溶液10 mL。无菌配制，4C保存A15 0.1%结晶紫溶液称取结晶紫10 mg，加10 ml无菌水，4保存。A16四环紊溶液(8 mg/mL)称取四环素40 mg，加人。.02 mol/L盐酸溶液5 mL，用于四环素抗性试验。无菌配制，4C保存。
