1、YY /T 0127. 10-2001 前言本标准主要依据GB15193.4-1994食品安全性毒理学评价程序和方法以及GB7919-1987(化妆品安全性评价程序和方法而制定。本标准废除并代替YY91042-1999(牙科复合树脂充填材料附录AA3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)。本标准与前版标准在主要技术内容上无差别，仅对操作步骤操作予以细化，并进行了编辑性修改。本标准为YY0268-1995(口腔材料生物学评价第1单元g口腔材料生物性能评价导则提供了具体的试验方法。本标准从实施之日起，同时代替YY91042-1999牙科复合树脂充填材料附录AA3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(
2、Ames试验)。本标准的附录A是标准的附录。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。本标准由国家药品监督管理局北医医疗梅械质量监督检验中心负责起草。本标准主要起草人=林红、刘文一、李盛琳。;); 1 范围中华人民共和国医药行业标准口腔材料生物学评价第2单元:口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)Biological evaluation of dental materials一Part 2, Biological evaluation test method of dental materials -Salmonella t
3、yphimurium reverse mutation assay CAmes mutagenicity test) 本标准规定了口腔材料鼠伤寒沙门氏杆离回复突变试验方法。YY /T 0127. 10-2001 代替YY91042-1999 附录AA3 本试验用于测定可引起沙门氏杆菌基因置换和/或移码突变的口腔材料所诱发的依赖于组氨酸(his -)的菌株产生不依赖于组氨酸(his+)的基因突变。为检测口腔材料的诱变性试验之一。2 苦1I目标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版
4、本的可能性。GB 7919-1987 化妆品安全性评价程序和方法GB 15193.4-1994 食品安全性毒理学评价程序和方法YY /T 0127.2-1993 口腔材料生物试验方法s静脉注射急性全身毒性试验ISO 7405-1997 牙科学一一用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价一一-牙科材料试验方法3 仪器3- 1 实验室常用设备3- 2 洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，低温高速离心机，低温冰箱(-80C)或液氮罐等。4 培养基和试剂的制备培养基和试剂的制备见附录A。5 菌株准备、鉴定和贮藏5. 1 菌株采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌共四株TA97、TA98、TAI00、TAI02
5、05.2 菌株贮存菌株贮存在加有二甲基亚飘的(光谱纯)新鲜细菌培养液中，其体积比为O.09 , 1.混合后分装于小国家药晶监督管理局2001-03-12批准2001 - 08 -01实施5 YY /T 0127.10-2001 试管或菌种管内，经干冰丙阁液(一75C)或液氮(-196C)速冻，在80C冰箱或一196C液氮中长期贮存。5.3 增菌培养从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37C振荡(100次/min)培养1012 h.活菌数应达10个/mL(或OD600句0.4)。细菌培养液从37C取出后，应立即放人冰浴中备用。试验需用当天孵育好的新鲜细菌。5.4 菌株鉴定5.4
6、.1 组氨酸需求(his-)试验凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。鉴定方法2在底层培养基平皿表面加人0.5m moI/L L-组氨酸0.1mL和O.5 m moI/L D-生物素。.1mL。用L棒铺开。对照平皿只加生物素不加组氨酸。用自金耳浸细菌培养液，在对照平血和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。囚株细菌可划在同一个平皿上，经37C孵育24h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生长，在对照平皿上不应生长。5.4.2 脂多糖屏障缺陷鉴定。fa突变)粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层BI!l多糖屏障已经破坏，因此一些大分
7、子物质能穿过菌膜进入商体内而抑制其生长。野生型菌株或含gal缺失的菌株则不受影响。鉴定方法z分别将每种细菌培养液0.1mL加到45C2 mL顶层培养基试管内，混匀后倾倒于营养琼脂培养基平皿表面，使其均匀分布。待固化后，取直径为6mm元菌滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶液10L.放到平皿中央。经3TC孵育24h后，罔绕圃纸片出现透明的抑菌环(直径大约14mm).说明此菌存在深粗型(rfa)突变。TA97、TA98、TA100、TA102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌元抑菌环。5.4.3 对紫外线敏感性鉴定(uvrB修复缺陷型的鉴定)具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证
8、明uvrB突变的存在。鉴定方法z用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。用黑纸覆盖平皿一半，在距离33cm处用15W紫外线杀菌灯照射平皿8s.经3TC孵育24h后观察结果。对紫外线敏感的菌株(TA97、TA98、TA100)只在未照射过的一半平皿土生长。而具有uvrB修复缺陷型的菌株(TA102)在紫外线照射(未盖黑纸的另一半平皿)后仍能生长。5.4.4 抗氨带青霉素(PKM101)试验(菌株R因子丢失鉴定)含R因子的试验菌株对氨带青霉素具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性，故需鉴定R因子是否存在。鉴定方法1:用自金耳浸细菌培
9、养液，在含氨韦青霉素乎皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。还应选用一个无抗性因子的菌株，以测定氨节青霉素的效应。经3TC孵育24h后，元抗性因子菌株不应生长。鉴定方法2:用自金耳浸细菌培养液，在营养琼l脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。将f占有氨带青霉素溶液的滤纸条与划线交叉放置.3TC孵育24h.如滤纸条周围细菌生长正常，说明试验菌株具有R因子。5.4.5 四环素(PAQ!)抗性的鉴定鉴定方法1:用自金耳浸细菌培养液，在含氨苇青霉素/四环素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。经3TC孵育24h后，对四环素有抗性的TA102菌株能生长，对四环素无抗性的菌株不生长
10、。鉴定方法2:用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。待干后，吸取四环素(8mg/mLl溶液与菌株划线处交叉划线.3TC孵育24h。对四环素有抗性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长。55 YY /T 0127. 10-2001 5.4.6 自发回变数(his+)的测定在小试管中加入融化的顶层培养基2mL.分别加入待测菌株的菌液0.1mL，迅速在高速液体混合器上混匀，倾倒在已固化的底层培养基平皿上，使其均匀分布。待固化后，经37C孵育48h.计数全部菌落数。一个菌株应做23个平皿，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值在一个恒定的范
11、围。各试验菌株的自发回变数分别为，TA97(97180);TA98(l560) ;TA100(75200); TA102(240360)。加过S-9的菌株，自发回变数稍有增加。5.4.7 对阳性突变剂的敏感性鉴定使用已知阳性对照剂，检查试验菌株的敏感性是否降低，其方法同7。6 代湖活化剂大鼠肝微粒体酶(8-9)J的诱导和制备6. 1 大鼠肝微挝体酶(S-9)的诱导选用体重150200g的健康雄性S-D大白鼠或体重1l0150g的Wistar大鼠。将多氯联苯(Aroclor 1254或国产PCB-五氯)溶于玉米泊中，浓度为200mg/mL.腹腔一次注射500mg/kg(体重)。第6天用颈动脉排空
12、血液法处死，处死前12h禁食不禁永。6.2 切取肝脏处死的大鼠经过无菌处理，打开腹腔，用20mL O. 15 mol!L氯化饵溶液(4C)进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出，整个过程应在元茵室中进行。离体以后的肝脏始终保持4C以下无菌操作。6. 3 S-9的制备制备S-9的一切器皿均应消毒，全部操作在冰水浴中进行。肝脏称重后，在0.15mol/L氯化仰溶液中洗涤数遍。每克重肝脏加0.15mol/L氯化饵溶液3mL。用剪刀剪碎肝脏，放人组织匀浆机中，以4000 r/min匀浆2mino将匀浆液放人低温(04C)高速离心机上，以9000g离心10min，其上层液即S-9，6.4 S-9贮
13、存吸取2mL上层液分装于小试管或安瓶中。在密封的条件下，用干冰丙翻液速冻后，贮存于一80C冰箱或掖氮容器中。保存期不超过一年。6. 5 S-9鉴定S-9制备后，应进行下列测定:a)元菌检查;b)蛋白含量测定(Lowry法);每毫升蛋白含量应不超过40mg , d细胞色素P-450测定;S-9活力还必须以标准致癌物进行测定，6. 6 S-9的剂量选择首先使用标准浓度的S-9混合液，测定其对已知阳性致癌物的生物活性，确定最适用量B如果是阴性结果，还应使用高浓度的S-9混合液重新试验。6. 7 S-9混合液制备=见附录AA8。7 受试样晶的制备试样制备可选用生理盐水、二甲基亚枫(DMSO)或其他溶剂
14、(毒性剂量以下).无论选用何种溶剂，均应无诱变性。将材料制备成溶液、混悬液或浸提液。浸提液制备按YY/T 0127.2规定的方法进行。7.1 受试样品剂量选择预试验用菌株TA100进行预试验(操作程序应与正式试验一致).以了解受试样品对细菌的毒性。56 YY /T 0127.10-2001 决定受试样品的最高剂量的标准是细胞毒性和溶解度。细胞毒性表现是:平皿中回复突变菌落数减少;背景菌苔变清晰，40倍显微镜下背景菌苔稀疏，体积增大等。毒性大的受试样品，选择有轻微毒性的剂量作为试验的最高剂量。毒性小、溶解度高的受试样品，最高剂量溶液50mg/mL，混悬液100 mg/mL，浸提液200mg/mL
15、 每种受试样品至少设五个剂量。8 诱变试验方法次试验最少设5个剂量组及阴性(溶媒)对照组和阳性对照组，代谢活化和非代谢活化两种测试过程应同时进行。试验结果在有背景菌苔存在情况下，计算每个平皿的回变菌落数，并需重复试验12次。8. 1 预培养法分别取0.1mL受试样品液、0.5mL S-9混合液(需代谢活化时加。不需代谢活化时加0.5mL不含S-9的磷酸缓冲液)、0.1mL细菌培养液。将三者移人无菌小试管内混合，在37C振荡培养20min , 再加入2mL顶层培养基，混匀后倾倒在底层培养基平皿上，使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转，经37C孵育48h观察结果。8.2 平板掺入法将含0.5m mo
16、l/L组氨酸生物素的顶层培养基2mL分装于小试管中，45C恒温水浴中保温，每管再依次加入0.1mL受试样品液、0.1mL细菌培养液和0.5mL S-9混合液(需代谢活化时加。不需代谢活化时加0.5mL不含S-9的磷酸缓冲液)，混匀后倾倒在底层培养基平皿上并使之均匀分布。待回化后，将平皿翻转，经37C孵育48h观察结果。9 结果评定记录试验组和对照组的每一平皿的回变菌落数，每个试验组的回变菌落数以平均值和标准差(X土SDl表示。受试样品的回变菌落数高于阴性对照回变菌落数的二倍以上，并有剂量-效应关系或某一个或某几个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性反应，贝u判为诱变阳性。, A1 顶层培养基
17、琼脂氯化锅蒸馆水YY /T 0127. 10-2001 附录A(标准的附录)培养基和试剂的制备1. 2g 1.0 g 200 mL 加热溶化后，加入O.5m mol/L组氨酸生物素溶液20mL, 121 cC 104 kPa 20 min高压灭菌。A2 底层培养基琼脂7.5 g 蒸惰水465 mL 121 C 104 kPa 20 min高压消毒后，趁热(80CC)在其内依次加人50X(V-B)培养基E10 mL和40%葡萄糖溶液25mL，混匀，按每皿30mL倒平皿，冷凝固化后倒置于3TC培养箱中24-48h。A3 Vogel-Bonner(V-B)培养基E(50X)硫酸续(MgSO. 7H,
18、O) 拘橡酸(C，H，O， H20) 磷酸氢二佣(K2HPO.)磷酸氢镀纳(NaNH.HP04 4H20) 加蒸馆水至100mL 25 g 250日1 250 g 437. 5 g 先将后三种潜解后，再加入硫酸侯，待兔全溶解后，分装于锥形瓶里.121C 104 kPa 20 min高压消毒。A4 40%葡萄糖溶液称取40g葡萄糖，加入蒸馈水至100mL .115 C 69 kPa 20 min高压消毒。4C保存。A5 曹养肉j$j培养基牛肉膏膜陈(或混合蛋白陈氯化锅磷酸氢二饵2.5 g 5.0 g 2.5 g 1. 0 g 蒸馈水500 mL 加热溶解，调pH至7.4.121cC 104 kP
19、a 20 min高压消毒。4CC保存。A6 曹养肉汤琼脂培养基琼脂粉肉汤培养基7.5 g 500 mL 加热溶化后，调pH至7.4.121cC 104 kPa 20 min高压消毒后，倒斜面或平皿。用于菌株鉴定、细菌活力鉴定或常规试验用菌株保存。SH YY /T 01 27. 10-2001 A7 0.5 rn rnol/L组氨酸-生物素溶液0-生物素(分子量247.3)L组氨酸盐(分子量191.7) 加蒸倒水至121 C 104 kPa 20 min高压消毒。c保存。A8 S-9混合液配制(按每毫升S-9混合液计算)30.9 mg 24.0 mg 250 mL 表Al标准浓度大鼠肝5-940
20、L O. 4 mol/L MgCl,-l. 5 mol/L KCl盐溶液20L 0.2 mol/L 6磷酸葡萄糖25L 0.2 mol/L辅酶E20L 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.的500严L无菌蒸馆水395 I-L lJ!匀，置冰浴中待用A9 MgCl，-KCl盐溶液(1.65rnol/L KCI+O. 4 rnol/L MgCI,) 氯化饵(KCl)氯化续(MgCI2 6H20) 蒸馆水加至121C 104 kPa 20 min高压消毒A 10 0.2 rnol/L辅酶11(NADP)浓浓NADP(分子量765.4)蒸馆水(元菌元菌条件下配制，分装于EP管中，一20C保存。A1
21、1 0.2 rnol/L 6-确戴葡萄糖(G-6-P)溶液G-6-P纳盐(分子量304.1) 蒸馆水(元菌无菌条件下配制，分装于EP管中，-20C保存。A 12 0.2 rnol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 磷酸二氢销(NaH，PO， 2H,O) (28.4 g/Ll 磷酸氢二锅(Na2日PO， 12H20)(27. 6 g/Ll 121C 104 kPa 20 min高压消毒。4C保存。A 13 0.15 rnol/L氯化饵溶液61. 5 g 40.7 g 500 mL 459.24 mg 3 mL 182.46 mg 3 mL 880 mL 120 mL 高浓度100L 20L 25L 20L 500L 335L 精确称取氯化梆ll.18g.用蒸馆水稀释至1000mL.121C 104 kPa 30 rnin高压消毒，冷却后冰箱保存，用于S-9制备。YY/T 0127.10-2001 A14 氨苓青霉素溶液8mg/mL) 称取三短氨青霉素80mg，加入0.02mol/L氮氧化纳溶液10mL，无菌配制，4C保存。A15 0.1%结晶紫溶液称取结晶紫10mg，加10mL元菌水，4.C保存。A16 四环素溶渡。mg/mL)称取四环素40mg，加入0.02mol/L盐酸溶液5mL，用于四环素抗性试验。元菌配制，4.C保存。(、1I
