1、1专题九 现代生物科技专题第 16 讲 基因工程与细胞工程1.基因工程的诞生() 2.基因工程的原理及技术(含 PCR 技术)() 3.基因工程的应用() 4.蛋白质工程() 5.植物的组织培养() 6.动物细胞培养与体细胞克隆() 7.细胞融合与单克隆抗体()(1)限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。()(2)Ecoli DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(3)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。()(4)应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。()(5)蛋白质工程是在分子水平上
2、对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。()(6)愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的。()2(7)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。()(8)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。()(9)与“多利”羊等克隆哺乳动物相关的技术有胚胎移植、细胞培养和核移植技术。()(10)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体。()1推测限制酶存在于原核生物中的作用。提示：原核生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止病原物的侵害。当外源 DNA 侵入时，限制酶会将 DNA 切割掉，以保证自身的安全。
3、2作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？提示：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子、标记基因等。3利用大肠杆菌可以生产人的胰岛素，能生产人的糖蛋白吗？提示：在蛋白质的肽链上加上糖链，需要内质网和高尔基体才能完成，大肠杆菌不存在这两种细胞器，故大肠杆菌不能合成糖蛋白。1(2018全国，T38)回答下列问题：(1)博耶( H. Boyer)和科恩(S. Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过
4、Ca2 参与的_方法导入大肠杆细菌细胞：而体外重组的噬菌体 DNA 通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体 DNA 导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。3(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过 Ca2 处理，目的是
5、以增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过 Ca2 参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体 DNA 通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体 DNA 导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的
6、抑制剂。答案：(1)体外重组的质粒可以进入体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶2(2017全国，T38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列的机制。已知在人体中基因 A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白 A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因 A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因 A 的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白
7、 A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因 A 是否翻译出蛋白 A，可用的检测物质是_(填“蛋白 A 的基因”或“蛋白 A 的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以4说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。解析：(1)基因 A 的编码区中有内含子和外显子，在真核生物细胞内把内含子转录来的RNA 切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接表达，所以翻译形成的蛋白质不是 A 蛋白。(2)由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法
8、侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。(3)大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养、遗传物质含量少、产物易分离、不会造成基因污染等。(4)检测目的基因是否表达通常用抗原抗体杂交技术，注入抗体看是否出现杂交带，若出现则表达。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，不仅证明了生物的遗传物质是 DNA，还证明了 DNA 可以从一种生物转移到另一种生物个体。答案：(1)基因 A 有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的 RNA 序列不能被切除，无法表达出蛋白 A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是
9、细菌，而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白 A 的抗体 (5)DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体3(2015全国，T40)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由 305 个氨基酸组成。如果将 P 分子中 158 位的丝氨酸变成亮氨酸，240 位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P 1)不但保留 P 的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以 P 基因序列为基础，获得 P1基因的途径有修饰_基因或合成_基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括
10、_的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_进行鉴定。5解析：(1)由题干信息可知改造蛋白质的功能，可通过改变蛋白质的结构实现。(2)依据蛋白质工程的定义及题中信息可知获得 P1基因的途径有修饰现有(P)基因或合成新(P 1)基因。中心法则的全部内容包括：DNA 的复制、RNA 的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的
11、脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。答案：(1)氨基酸序列(或结构) (2)P P 1 DNA 和 RNA(或遗传物质) DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计蛋白质结构 推测氨基酸序列 功能4(2018全国，T38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5末端，获得了 L1GFP 融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒 P0，构建了真核表达载体 P1，其部分结构和酶切位
12、点的示意图如下，图中 E1E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。启动子 L1 基因 GFP 基因 终止子 E1 E2 E3E4回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒 P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是_。使用这两种酶进行酶切是为了保证_，也是为了保证_。(2)将 P1 转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_移入牛的_中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用 PCR 方法进行鉴定，6在鉴定时
13、应分别以该牛不同组织细胞中的_(填“mRNA” “总 RNA”或“核 DNA”)作为 PCR 模板。解析：(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5末端而获得的 L1GFP 融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒 P0 时，如果用 E2 或 E3，则目的基因不完整，而使用 E1 和 E4 这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是 E1 和 E4。(2)构建的真核表达载体 P1 中含有 GFP 基因，而 GFP 基因的
14、表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入 P1 的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR 是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定 DNA 片断的核酸合成技术。若利用 PCR 方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核 DNA 作为 PCR 模板。答案：(1)
15、E1 和 E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核 DNA5(2013全国，T40)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分 A，乙含有效成分 B。某研究小组拟培育同时含有 A 和 B 的新型药用植物。回答下列问题：(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用_酶和_酶去除细胞壁，获得具有活力的_，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成_组织，然后经过_形成完整的杂种植株。这种培育技术称为_。(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指_。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异
16、的原因是_。(3)这种杂交植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的7_等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。解析：(1)该新型药用植物是通过植物体细胞杂交技术获得的。要获得有活力的原生质体才能进行体细胞杂交，因此首先用纤维素酶和果胶酶去掉植物的细胞壁，然后用 PEG 化学诱导剂(物理方法：离心、振动等)诱导二者的原生质体整合。然后采用植物组织培养技术获得杂种植株，植物组织培养的主要过程是：先脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成植物体，利用了植物细胞的全能性。(2)如果植物甲、乙是两个物种，二者不能通过有性杂交产生可育后代，原因是甲、乙有性杂交所产生的后代在减数分裂过程中同源染
17、色体联会异常，也就是存在着生殖隔离。但植物甲、乙通过植物体细胞杂交技术产生的后代却是可育的，因为在减数分裂过程中同源染色体能完成正常的联会，产生正常的配子。由于甲、乙都是二倍体，因此，植物体细胞杂交得到的后代是异源多倍体(四倍体)。(3)人工种子生产不受气候、季节和地域等因素限制，而且可以避免后代不发生性状分离等优点，因此，植物细胞工程重要的应用之一是制备人工种子，用到的核心技术是植物组织培养技术。将植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。答案：(1)纤维素 果胶 原生质体 愈伤 再分化(分化) 植物体细胞杂交技术 (2)体细胞中含有三个或三个以上染色
18、体组的个体 在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常 (3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽 6(2017全国，T38)编码蛋白甲的 DNA 序列(序列甲)由 A、B、C、D、E 五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图 1 所示。回答下列问题：(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA 序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_。(2)某同学在用 PCR 技术获取 DNA 片段 B 或 D 的过程中，在 PCR 反应体系中加入了8DNA 聚合酶、引物等，还加
19、入了序列甲作为_，加入了_作为合成 DNA 的原料。(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T 淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含 T 淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测 T淋巴细胞浓度，结果如图 2。由图 2 可知，当细胞浓度达到 a 时，添加蛋白乙的培养液中 T 淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使 T 淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的 CO2浓度，CO 2的作用是_。仅根据图 1、图 2 可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_(
20、填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激 T 淋巴细胞增殖的效果。解析：(1)题干信息基因序列(TTCG)，可知其转录出的 mRNA 上没有起始密码子AUG。(2)根据 PCR 的条件需要，引物、耐高温 DNA 聚合酶、模板、四种脱氧核糖核苷酸作为原料。(3)T 细胞浓度之所以不增加是因为营养物质耗尽，所以可以更换培养液，补充营养物质；CO 2作用为课本基础知识。(4)据图分析，丙与对照接近说明 BD 片段重要性较弱，甲和乙都有较大影响，他们中共同的片段是 C，所以缺少 C 片段会降低效果。答案：(1)编码乙的 DNA 序列起始端无 ATG，转录出的 mRNA 无起
21、始密码子 (2)模板 dNTP (3)进行细胞传代培养 维持培养液的 pH C7(2014全国，T40)某研究者用抗原(A)分别免疫 3 只同种小鼠(X、Y 和 Z)，每只小鼠免疫 5 次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图所示。9若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的 B 淋巴细胞(染色体数目为 40 条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目为 60 条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗 A 抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题：(1)制备融合所需的 B 淋巴细胞时，所用免疫
22、小鼠的血清抗体效价需达到 16 000 以上，则小鼠最少需要经过_次免疫后才能有符合要求的。达到要求的 X、Y、Z 这 3 只免疫小鼠中，最适合用于制备 B 淋巴细胞的是_小鼠，理由是_。(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有_，体系中出现多种类型细胞的原因是_。(3)杂交瘤细胞中有_个细胞核，染色体数目最多是_条。(4)未融合的 B 淋巴细胞经过多次传代培养后都不能存活，原因是_。解析：(1) 在第四次免疫后，Y 的血清抗体效价大于 16 000，所以最少需要经过四次免疫。由图可知，血清抗体效价均达到 16 000 以上时， Y 的效价最大，最适合用于
23、制备B 淋巴细胞。(2)B 细胞与骨髓瘤细胞在一起融合时，可能发生 B 细胞与骨髓瘤细胞融合，B 细胞之间的融合，骨髓瘤细胞之间的融合。由于细胞融合是随机的，且融合率达不到 100%故体系中会出现多种类型的细胞。(3)由于核膜也具有流动性，故小鼠的免疫 B 淋巴细胞核与其骨髓瘤细胞核会融合形成一个杂交的细胞核。B 细胞有 40 条染色体，骨髓瘤细胞有 60条染色体，融合后的杂交瘤细胞有 100 条染色体。(4)未融合的 B 淋巴细胞是已分化的细胞，不能无限增殖，所以多次培养后不能存活。答案： (1)4 Y Y 小鼠的血清抗体效价最高 (2)B 淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成
24、的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到 100% (3)1 100 (4)不能无限增殖10考点一 基因工程1基因工程的基本工具(1)限制酶DNA 酶解旋酶限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA 酶是将 DNA 水解为基本组成单位；解旋酶是将 DNA 的两条链间的氢键打开形成两条单链。(2)使用限制酶的注意点一般用同种限制酶切割载体和目的基因。不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。(3)DNA 连接酶DNA 聚合酶DNA 连接酶连接两个 DNA 片段，而 DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。112基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取途
25、径方法 具体操作直接分离 从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取化学合成已知核苷酸序列的较小基因，直接利用 DNA 合成仪用化学方法合成，不需要模板逆转录法 以 mRNA 为模板，在逆转录酶作用下人工合成人工合成PCR 技术扩增原理：DNA 复制；条件：模板 DNA、引物、脱氧核苷酸、热稳定的 DNA聚合酶 过程Error!(2)基因表达载体的构建重组质粒的构建表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因复制原点。启动子和终止子：启动子是 RNA 聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。(3)将目的基因导入受体细胞植物细胞 动物细胞 微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花
26、粉管通道法显微注射技术感受态细胞法(用 Ca2 处理)受体细胞 受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞12(4)目的基因的检测与鉴定导入检测：DNA 分子杂交技术(使用 DNA 探针)。表达检测Error!个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。(1)基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。(2)启动子、终止子启动子(DNA 片段)起始密码子(位于 mRNA 上)。终止子(DNA 片段)终止密码子(位于 mRNA 上)。3蛋白质工程1(2017全国，T38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回
27、答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的 mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取 RNA 时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，其目的是_。13(2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是_。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是_。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。解析：(1)在进行基因工程操作时，若
28、要从植物体中提取几丁质酶的 mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取 RNA 时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，其目的是防止 RNA 降解。(2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则可以合成 cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子和终止子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的
29、基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止 RNA 降解 (2)在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则可以合成 cDNA (3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常2(2016全国，T40)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活( Ampr表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用 BamH I 酶切后，与用 BamH I 酶切获得的目的基因混合，加
30、入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：14(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆
31、菌的单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于_。解析：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。(2)在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有
32、四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因( Tetr )失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。(3)噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的 DNA 进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的 DNA 的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该15培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质
33、粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞3(2018陕西第二次联考)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)大肠杆菌质粒常作为基因工程目的基因的载体，另外，_和_也可作为载体。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_。(2)利用转基因技术实现胰岛素的批量生产是目前糖尿病治疗的新思路，该过程中的关键操作环节是_。(3)对于胰岛素基因的获取，途径之一是通过提取_细胞中的胰岛素 mRNA，经过_过程合成，之后通过_技术大量扩增。解析：(1)基因工程常用的运载体有大肠杆菌质粒、 噬菌体的衍生物、
34、动植物病毒；未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源 DNA)的能力极弱，因此不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞。(2)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。(3)胰岛素基因只能在胰岛 B 细胞选择性表达，因此应该从胰岛 B 细胞提取胰岛素mRNA，经过逆转录形成胰岛素基因，再通过 PCR 技术大量扩增目的基因。答案：(1) 噬菌体的衍生物 动植物病毒 未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源 DNA)的能力极弱 (2)基因表达载体的构建 (3)胰岛 B 逆转录 PCR4(2018安徽滁州期末)苹果等果实的果肉细胞液泡中有丰富的无色的多酚类营养物质，其他一些囊泡结构中含有多酚氧化酶(PPO)，催化多酚氧化成褐
35、色物质，此过程称为果实褐变。科学家利用基因沉默技术培育了一种不褐变的转基因苹果。回答下列问题：(1)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是_，该方法中需将目的基因插入到农杆菌的_上。(2)培育不褐变的苹果采用的是第二代基因工程技术，导入的是苹果细胞原本就有的多酚氧化酶基因(PPO 基因)，当细胞内有许多份 PPO 基因时，PPO 基因_形成的 mRNA之间容易形成双链区而失去_机会，从而导致多酚氧化酶含量大大减少。基因沉默分为转录水平的沉默(TGS)和转录后水平的沉默(PTGS)，则培育不褐变苹果的转基因沉默属于_(填“TGS”或“PTGS”)。16(3)可用_酶从苹果基因组中切取 PPO 基
36、因，也可用 PCR 技术从苹果基因组中克隆出 PPO 基因，则要实现 PCR 定点克隆 DNA 片段，最关键的是设计_。解析：(1)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法、花粉管通道法等；该方法中，应该将目的基因插入农杆菌 Ti 质粒的 TDNA(可转移DNA)上。(2)PPO 基因通过转录形成 mRNA，若形成的 mRNA 过多，容易形成双链区，导致不能正常翻译形成蛋白质(多酚氧化酶)，导致多酚氧化酶含量大大降低；由于以上过程导致翻译不能正常进行，因此属于转录后水平的沉默(PTGS)。(3)PPO 基因为目的基因，可以利用限制酶进行切割；实现 PCR 定点克隆
37、DNA 片段的技术是 PCR，该技术最关键是设计引物序列。答案：(1)农杆菌转化法 Ti 质粒的 TDNA (2)转录 翻译 PTGS (3)限制 引物序列5(2018安徽皖北协作区联考)某些微生物能表达黄曲霉毒素 B1(AFB1)解毒酶。将该酶添加在饲料中可以降解 AFB1，清除其毒性。下图为采用基因工程技术生产 AFB1解毒酶的流程图。 含 AFB1解 毒 酶 基因 的 菌 株 总 RNA cDNA PCR AFB1解毒 酶 基 因 构 建 酵 母工 程 菌 表 达 纯 化 AFB1解 毒 酶据图回答问题：(1)过程需要选择含解毒酶的菌液中的细胞提取总 RNA，理由是_。(2)过程中，需要
38、用引物的原因是_。(3)构建酵母工程菌最常用的运载工具是_，操作程序中关键环节是_，检测酵母工程菌中 AFB1解毒酶基因是否转录，应采用_方法。(4)采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的_，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的_。解析：(1)由于菌液中含解毒酶，意味着细胞中解毒酶基因的正常(完成了)表达，所以过程应选择甲菌液的细胞提取总 RNA。17(2)由于 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3端延伸 DNA 链，因此过程中，需要用引物。(3)构建酵母工程菌时，常用的运载体是质粒，关键步骤是构建基因表达载体；转录的产物是 mRNA，可以利用分
39、子杂交法进行检测。(4)蛋白质工程的本质是通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，所以设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列，从而提高酶的活性。答案：(1)菌液中含解毒酶，意味着细胞中解毒酶基因的正常(完成了)表达 (2)DNA聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3端延伸 DNA 链 (3)质粒 构建基因表达载体 分子杂交 (4)蛋白质结构 脱氧核苷酸序列考点二 克隆技术1理清植物组织培养的流程(1)条件：无菌、离体。(2)培养基组成：无机营养、有机营养、激素、琼脂。(3)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。(4)
40、植物组织培养的目的不同，培养阶段也就不同：若生产人工种子，则培养到胚状体阶段。若提取细胞产品，则一般培养到愈伤组织阶段。18若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。2理清植物体细胞杂交技术(1)酶解方法：用纤维素酶和果胶酶处理。(2)促融方法：物理法：离心、振动、电激等；化学法：聚乙二醇(PEG)。(3)植物体细胞杂交即将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的过程，不管是染色体数、基因型还是染色体组数都采用直接相加的方法。3动物细胞培养(1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞。第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱
41、落下来。(2)传代细胞的特点传代培养到 10 代以内的细胞核型稳定，1050 代时部分细胞核型发生变化，50 代以后遗传物质可能发生变化。(3)原代培养与传代培养的区别区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。贴壁生长到一定程度需要用胰蛋白19酶处理，然后再分瓶培养，原代培养结束，开始传代培养。(4)动物细胞培养的条件无菌、无毒的环境；特殊营养：血清、血浆；适宜的温度和 pH；气体环境：含 95%空气加 5%CO2的混合气体。4动物细胞核移植技术(1)选择受体细胞为去核卵母细胞的原因营养丰富；体积大，易操作；含有激发细胞核全能性表达的物质。(2)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能
42、不同的三个原因：克隆动物遗传物质来自两个亲本。发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。外界环境可能引起不遗传的变异。5动物细胞融合与单克隆抗体20(1)3 种细胞特点不同免疫后的 B 淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。(2)2 次筛选目的不同第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即 AB 型细胞(A 为 B 淋巴细胞，B 为骨髓瘤细胞)，该细胞既能分泌抗体又能大量增殖，筛选掉 A、B、AA、BB 型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原抗体杂交法筛选，获得产生特异性抗体的杂交瘤细胞。1(2017海南，T
43、31)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是_。(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到_。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是_(填“具有完整的细胞核” “具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。(3)图中 A、B、C 所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是_。A 中的愈伤组织是叶肉细胞经21_形成的。(4)若该种植物是
44、一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，_(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是_。解析：(1)植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性。(2)蔗糖水解后可得到葡萄糖、果糖。用细胞作为材料进行培养获得幼苗，细胞必须具有完整细胞核，才具有发育为个体的一整套完整遗传信息。(3)影响植物组织培养的两种主要激素是细胞分裂素和生长素。愈伤组织是叶肉细胞经脱分化形成的。(4)由于花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，组织培养得到花卉基因型不同于原植株，导致不能保留亲本性状。答案：(1)绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性，在一定条件下能发育成完整的植株 (2)葡萄糖、果糖 具有完整的细胞核 (3)细胞
