1、第36讲 克隆技术,-2-,-3-,教材梳理,题型探究,真题演练,植物的克隆 1.植物细胞的全能性和植物组织培养 (1)全能性:植物体的每个生活细胞都具有 上的全能性,因而都具有发育成 的潜能。 (2)植物细胞全能性表达的条件 离体、 。 一定的营养物质,如水、无机盐、蔗糖、维生素等。 。 (3)植物组织培养程序 配制培养基:配制含有适当 和的半固体培养基 切取 的组织块,遗传,完整植株,无菌,植物生长调节剂,营养物质,植物生长调节剂,消毒,-4-,教材梳理,题型探究,真题演练,获得愈伤组织:由相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织,-5-,教材梳理,题型探究,真题演练,2.细胞培养和器官
2、培养 (1)方法:主要是通过平衡的 配比进行调控,以实现器官的发生和形态建成。 适量的 和 配比,可诱导芽的分化。 适量的 及适当减除其他某些激素,可诱导生根。 (2)意义 可以在实验室、试管等器皿中进行植物 过程和自受精卵进行的植物 过程,以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究。 可以进行 的操作,完成与植物有关的重要基因或影响因素的研究。 可以方便地通过 培育植物新品种。,植物激素,生长素,细胞分裂素,吲哚乙酸,受精,胚胎发育,遗传工程,生长发育,实验手段,-6-,教材梳理,题型探究,真题演练,3.原生质体培养与植物细胞工程 (1)原生质体培养,原生质体吸水胀破,
3、甘露醇,果胶酶,-7-,教材梳理,题型探究,真题演练,(2)植物细胞工程的操作过程,-8-,教材梳理,题型探究,真题演练,4.多途径的植物克隆实践 (1)培育抗逆、高产及优质的 。 (2)通过培养特定细胞系,实现能产生重要 的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。 (3) 育种。 (4)诱发、筛选突变体。,转基因植株,次生代谢产物,单倍体,-9-,教材梳理,题型探究,真题演练,(1)图中基因工程的载体是 ,目的基因是 。甲乙过程需要的工具酶是 。 (2)基因工程的核心是 。 A.乙的构建 B.丙的形成 C.丁的筛选 D.戊的培育,考向一 植物细胞全能性和组织培养方法 【典例1-1】 利用生物工程培
4、育抗虫植物的过程如图所示。请据图回答下列问题。,-10-,教材梳理,题型探究,真题演练,(3)丁戊过程说明植物细胞具有 。在这个过程中,丁细胞在特定的刺激下发生 成为具有分裂能力的细胞,并且不断地分裂增殖形成愈伤组织。通过调节营养和生长调节剂的配比,从愈伤组织诱导出 ,并由此再生出新植株。 (4)丁戊过程中形成的愈伤组织,可通过液体悬浮培养分散成单细胞。下列特征中,这种细胞不具有的是 。 A.细胞质丰富 B.液泡大 C.可发育成胚状体 D.细胞核大,-11-,教材梳理,题型探究,真题演练,答案:(1)Ti质粒(甲) 抗虫基因 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 (2)A (3)全能性 脱分化 芽和
5、根 (4)B 解析:(1)图示为转基因植物的培育过程,在图示中,基因工程的载体是农杆菌的Ti质粒,目的基因是抗虫基因。甲到乙表示形成重组DNA分子的过程,需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(2)基因工程的核心是构建重组DNA分子,分析图示,乙表示重组DNA分子的构建。(3)丁到戊表示植物细胞发育成完整植株的过程,体现了植物细胞具有全能性。由植物细胞发育成完整植株,一般会经历脱分化形成愈伤组织,然后愈伤组织再分化形成芽和根,最终发育成植株的过程。(4)愈伤组织细胞具有细胞核大,营养物质丰富,液泡小等特征,并保留发育成胚状体的能力。,-12-,教材梳理,题型探究,真题演练,归类提升植物克隆有
6、关的几种技术的比较,-13-,教材梳理,题型探究,真题演练,-14-,教材梳理,题型探究,真题演练,(1)据此烟草叶片原生质体分离和培养的流程图,下列分析错误的是( ) A.可用红墨水染色的方法检测原生质体有无活性 B.过程需在一定浓度的甘露醇溶液中用纤维素酶和果胶酶处理 C.过程要求生长素与细胞分裂素的比例合适 D.上述过程中可发生染色体畸变、基因突变和基因重组,考向二 原生质体培养与植物细胞工程 【典例1-2】 下面是烟草叶片原生质体分离和培养的流程图,请回答下列问题。,-15-,教材梳理,题型探究,真题演练,(2)将原生质体制成悬浮液培养分散的单细胞,这种单细胞具有 细胞的特性,在适宜的
7、培养基中,可以发育成 ,继续培养发育可以形成植株。 (3)若要用显微镜观察并计数悬浮液培养分散的单细胞,则需要把悬浮液滴加在 上,假如还要判定原生质体是否已形成细胞壁,可用 方法鉴别。 (4)欲通过原生质体培养得到愈伤组织,从培养基的成分考虑,配制培养基时需要注意的主要方面有 的适当配比和 的适当配比。,-16-,教材梳理,题型探究,真题演练,(5)下列有关高等植物原生质体制备和培养的叙述,正确的是( ) A.由于植物细胞壁的存在,植物的组织培养和克隆有一定的难度 B.加入0.6 mol/L甘露醇的目的是保护纤维素酶和果胶酶 C.从不同植物组织分离得到的原生质体亚显微结构相同 D.原生质体是除
8、细胞膜以外的细胞中有代谢活性的原生质部分,答案:(1)D (2)胚性 胚状体 (3)血细胞计数板 质壁分离 (4)营养物质 植物生长调节剂 (5)A,-17-,教材梳理,题型探究,真题演练,解析:(1)活细胞的细胞膜有选择透性,红墨水不能进入细胞内;死细胞的细胞膜失去选择透性,红墨水可以进入细胞内,所以可用红墨水染色的方法检测原生质体有无活性,A项正确。表示获得原生质体,需要在较高浓度的甘露醇溶液中,用纤维素酶和果胶酶混合液处理,B项正确。获得愈伤组织的过程需要生长素和细胞分裂素的比例合适,C项正确。基因重组发生在有性生殖过程中,图示过程中不会发生基因重组,D项错误。(2)将原生质体制成悬浮液
9、培养分散的单细胞,这种单细胞具有胚性细胞的特性,液泡小而细胞核大,在适宜的培养基中可以发育成胚状体,继续培养发育可以形成植株。(3)可用血细胞计数板对细胞进行计数。要判定原生质体是否已形成细胞壁,可用质壁分离的方法鉴别。,-18-,教材梳理,题型探究,真题演练,(4)欲通过原生质体培养得到愈伤组织,从培养基的成分考虑,配制培养基时需要注意的主要方面是营养物质及植物生长调节剂的适当配比。(5)由于植物细胞壁的存在,使植物组织培养和克隆有一定的难度,A项正确。制备原生质体时,加入0.6 mol/L甘露醇的目的是防止原生质体吸水胀破,B项错误。不同植物组织细胞的形态结构和功能不同,故从不同植物组织分
10、离得到的原生质体亚显微结构可能不同,C项错误。原生质体是指植物细胞去掉细胞壁后剩下的部分,包括细胞膜、细胞质和细胞核,D项错误。,-19-,教材梳理,题型探究,真题演练,考向三 植物克隆的综合应用 【典例1-3】 (2018浙江宁波九校期末联考)苦荞富含黄酮类化合物等营养物质,在降血糖、降血脂等方面功效显著。查尔酮合成酶(CHS)是黄酮类化合物合成的关键酶,如图为将CHS基因导入苦荞,培育高产黄酮苦荞品系示意图。据图回答下列问题。,-20-,教材梳理,题型探究,真题演练,(1)基因工程的核心是 。 (2)可利用 、 方法获取CHS基因。 (3)过程中切开质粒的酶是 。它能在质粒特定的部位切割的
11、原因是 。 (4)过程分别是 。苦荞细胞能培养成植株的根本原因是 。 (5)为培育转基因苦荞植物,还可将该植物幼叶消毒后,用 酶混合液处理,获得原生质体。酶混合液中含有适宜浓度的甘露醇,其作用是 。将目的基因导入到原生质体,经培养形成愈伤组织,再通过 得到分散的胚性细胞,发育成 ,生长发育后获得该转基因植株。,-21-,教材梳理,题型探究,真题演练,(6)愈伤组织继代次数过多会丧失细胞全能性的表达能力,下列原因错误的是 。 A.愈伤组织发生遗传变异 B.愈伤组织不能分散成单细胞 C.愈伤组织中激素平衡发生改变 D.愈伤组织对外源激素敏感性发生改变,答案:(1)构建重组DNA分子 (2)从基因文
12、库中获取 化学方法合成或PCR扩增 (3)限制性核酸内切酶 能识别特定的核苷酸序列并在特定的位点切割DNA分子 (4)脱分化、再分化 植物细胞的全能性(或细胞中含有发育成完整个体所必需的全部基因) (5)纤维素酶和果胶(写全才可) 维持渗透压 液体悬浮培养 胚状体 (6)B,-22-,教材梳理,题型探究,真题演练,解析:(1)基因工程的核心是构建重组DNA分子。(2)CHS基因为目的基因,其获取方法有从基因文库中获取、化学方法合成或PCR扩增。(3)质粒的化学本质是DNA,切开质粒的酶是限制性核酸内切酶;由于限制性核酸内切酶能识别特定的核苷酸序列并在特定的切点上切割DNA分子,所以它能在质粒特
13、定的部位切割。(4)过程为植物的组织培养过程,分别是脱分化、再分化;由于植物细胞具有全能性,所以苦荞细胞能培养成植株。(5)植物细胞用纤维素酶和果胶酶处理,去除细胞壁,获得原生质体;制备原生质体时,酶混合液中含有适宜浓度的甘露醇,有利于维持渗透压;将目的基因导入到原生质体,经培养形成愈伤组织,再通过液体悬浮培养得到分散的胚性细胞,发育成胚状体,生长发育后获得该转基因植株。(6)愈伤组织继代次数过多会发生遗传变异、激素平衡的改变、对外源激素敏感性的改变,使得愈伤组织丧失细胞全能性的表达能力。,-23-,教材梳理,题型探究,真题演练,(2018浙江4月选考,32节选)回答与基因工程和植物克隆有关的
14、问题。 (1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR酶切,在切口处形成 。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成 ,获得重组质粒。 (2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 ,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。,-24-,教材梳理,题型探究,真题演练,(3)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行 ,然后接种到培养基中培养,幼胚发生
15、形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及(答出2点即可)。,答案:(1)粘性末端 磷酸二酯键 (2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 (3)消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数,-25-,教材梳理,题型探究,真题演练,解析:(1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶剪切得到的是粘性末端,DNA连接酶连接两个DNA片段之间形成的是磷酸二酯键。(2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。Ca2+处理方法增加细菌细胞壁的通透性,
16、让其处于感受态细胞,以利于重组质粒导入。故细胞要正常表达相关基因,应让其恢复为正常状态。(3)因不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传的差异,细胞全能性的表达程度大小不同,小麦水稻等作物在多次继代培养后,会丧失细胞全能性的表达能力。,-26-,教材梳理,题型探究,动物的克隆 1.动物细胞、组织培养 (1)动物克隆的技术基础是 。 (2)动物细胞培养的过程:动物细胞培养包括 、 及三个阶段。分散组织细胞常用的方法有和 。 (3)原代培养和传代培养 原代培养:从 取出后立即进行的细胞、组织培养的过程。 传代培养:将 分成若干份,接种到若干份培养基中,使其继续生长、增殖。,动物的细胞和组织培
17、养,组织块的切取,组织细胞的分散,细胞培养,机械消化,胰酶消化,机体,原代培养细胞,-27-,教材梳理,题型探究,2.细胞系和细胞株,(2)细胞株:通过一定的选择或纯化方法,从 中获得的具有 的细胞,可分为 细胞株和细胞株。,连续,异体致瘤性,接触抑制,二倍体细胞,原代培养物或细胞系,特殊性质,连续,有限,-28-,教材梳理,题型探究,3.动物的克隆培养法 (1)概念:把一个单细胞从群体中分离出来 培养,使之繁衍成一个 的技术叫做克隆培养法或细胞克隆。 (2)基本要求:必须保证分离出来的细胞是 而不是多个,即必须肯定所建成的克隆来源于 细胞。 (3)克隆对象的选择:选择对培养环境具有较大 和具
18、有较强 的细胞。单细胞通常不如细胞; 细胞和 细胞系通常不如无限细胞系、转化或 细胞。,单独,新的细胞群体,一个,单个,适应范围,独立生存能力,群体,原代,有限,肿瘤,-29-,教材梳理,题型探究,(5)细胞克隆的最主要用途:细胞克隆的最主要用途之一,就是从细胞系中分离出 的突变细胞系。例如,研究缺少某种特殊蛋白的细胞,可以发现正常细胞中这种蛋白质的功能。,血清,滋养细胞,普通,缺乏特殊基因,-30-,教材梳理,题型探究,4.动物的细胞融合技术及其应用 (1)细胞融合 概念:细胞融合是指 个或 个细胞融合成一个细胞的现象。 原理:细胞膜的 。 诱导融合的方法:聚乙二醇、 病毒、电融合技术等。
19、应用:基因在染色体上的 ;制备 抗体。 (2)单克隆抗体的制备 原理:B淋巴细胞可以合成 ,但寿命有限,它与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞进行融合后产生的杂种细胞,既能产生特殊的 ,又能在组织培养条件下进行 。,两,多,流动性,灭活的仙台,定位,单克隆,抗体,抗体,无限繁殖,-31-,教材梳理,题型探究,过程,免疫,杂交瘤,腹腔,体外,-32-,教材梳理,题型探究,两次筛选的比较,优点: 、 ,可大量制备。 用途:用于治疗疾病;作为特异 ,研究相应 的结构、细胞学分布及其 。,杂交,杂交瘤,抗体,特异性强,灵敏度高,探针,抗原蛋白,功能,-33-,教材梳理,题型探究,5.动物的克隆繁殖 (1)动
20、物难以克隆的根本原因 在动物的个体发育过程中,分化的结果使得细胞在形态和功能上 ,这是由于细胞内伴随着它们在发育过程中时间、空间的变化, 的调控使得细胞中合成了专一的 。 (2)核移植 核移植:利用一个细胞的 来取代另一细胞中的细胞核,形成一个重建的“ ”。 动物的克隆繁殖,高度特化,基因表达,蛋白质,细胞核(供体核),合子,卵细胞,重组细胞,克隆动物,-34-,教材梳理,题型探究,考向一 动物细胞和组织培养 【典例2-1】 下图为动物细胞培养的基本过程示意图,请回答下列问题。,(1)容器A中放入的一般是幼龄动物的器官或组织,原因是其细胞 、易于培养。培养时先要剪碎,然后用 分散细胞,制成B瓶
21、中的细胞悬液。将细胞悬液转入C瓶中进行的初次培养称为 。,-35-,教材梳理,题型探究,(3)为保证无菌、无毒的环境,B、C、D瓶中的培养基中需要添加一定量的 ;还需要提供O2和CO2等气体环境,CO2的作用主要是 。 (4)动物细胞体外培养时,通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。下图表示血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果。据图可知,培养 细胞一定需要添加血清。,-36-,教材梳理,题型探究,答案:(1)分裂能力强 胰蛋白酶 原代培养 (2)连续细胞系 异倍体 (3)抗生素 维持培养液的pH (4)正常 解析:(1)动物细胞培养是利用细胞增殖能力以获取大量动物细胞的技术。幼龄动物的器
22、官或组织中的细胞分裂能力强,适宜培养;胰蛋白酶处理可去除细胞粘连蛋白,使细胞分散开来;从机体中取出的细胞经分散处理后立即进行的培养称为原代培养。(2)能够连续培养下去的细胞系称为连续细胞系,题中明确说明这些细胞可无限增殖,故属于连续细胞系;连续细胞系被认为是发生了转化的细胞系,大多具有异倍体核型。(3)加入一定量的抗生素可杀灭病菌,防止对动物细胞的生长增殖造成影响;CO2的作用主要是维持动物细胞正常生长所需的pH。(4)据图中实验结果可知,是否添加血清对癌细胞的数量影响不大,但明显影响正常细胞的数量,故正常细胞培养过程一定要添加血清。,-37-,教材梳理,题型探究,易混辨析比较动物细胞培养、核
23、移植与动物细胞融合,-38-,教材梳理,题型探究,-39-,教材梳理,题型探究,考向二 动物细胞融合及单克隆抗体制备 【典例2-2】 请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。 (1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时,利用一定的物质,如生物诱导剂 作介导,使经免疫的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选出融合的细胞再进行细胞的 培养,获得纯系细胞,同时还要进行 检验,以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。 (2)获得杂交瘤细胞后,在体外培养时需要特别加入的天然成分是 。,-40-,教材梳理,题型探究,(3)有关杂交瘤细胞体外培养的叙述,正确的是 。 A.用固体培养基培养 B.用滋养层细胞支持生长 C.
24、能进行传代培养 D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物 (4)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体,科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导入到受体细胞,该技术的核心步骤是 ,噬菌体是这些关键基因的 。,答案:(1)灭活的(仙台)病毒 克隆化 抗体 (2)动物血清 (3)C (4)构建重组DNA分子 载体,-41-,教材梳理,题型探究,解析:(1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时,利用一定的物质,如生物诱导剂灭活的(仙台)病毒作介导,使经免疫的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选出融合的细胞再进行细胞的克隆化培养,获得纯系细胞,同时还要进行抗体检验,以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。(2)获得杂
25、交瘤细胞后,在体外培养时需要特别加入的天然成分是动物血清。(3)杂交瘤细胞体外用液体培养基培养,A项错误;用滋养细胞支持生长,不是用滋养层细胞支持生长,B项错误;杂交瘤细胞能进行传代培养,C项正确;抗体为分泌蛋白,不需要对细胞进行研磨破碎获得产物,D项错误。(4)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体,科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导入受体细胞,该技术的核心步骤是形成重组DNA分子,噬菌体是这些关键基因的载体。,-42-,教材梳理,题型探究,易错提醒(1)细胞融合完成的标志是细胞核融合成一个核。 (2)杂交瘤细胞的特性是既能无限增殖,又能产生大量特异抗体。 (3)获取单克隆抗体的两
26、个场所:若在培养基中进行杂交瘤细胞培养,则从培养液中提取;若在小鼠或其他动物腹腔中培养,则从腹水中提取。 (4)在单克隆抗体制备过程中,一般认为有两次筛选过程,第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基),第二次是进一步筛选出能产生人们所需抗体的杂交瘤细胞。 (5)用特定的选择培养基筛选:未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长。 (6)单克隆抗体优点:特异性强、灵敏度高,可大量制备。,-43-,教材梳理,题型探究,考向三 动物的克隆繁殖 【典例2-3】 人的血清白蛋白在临床上需求量很大,通常从人血中提取。由于艾滋病
27、病毒(HIV)等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增,使人们对血液制品顾虑重重。如果将人的血清白蛋白基因导入奶牛细胞中,那么利用牛的乳汁来生产血清白蛋白就成为可能。大致过程如下: a.将人的血清白蛋白基因导入雌性奶牛胚胎细胞,形成重组细胞; b.取出重组细胞的细胞核,注入牛去核卵细胞中形成重组细胞; c.电脉冲刺激重组细胞,促使其形成早期胚胎; d.将胚胎移植到母牛的子宫中,最终发育成转基因小牛。,-44-,教材梳理,题型探究,-45-,教材梳理,题型探究,请回答下列问题。 (1)重组细胞的获得是利用了 技术,它实现了奶牛胚胎细胞中的DNA与 的重组。 (2)重组细胞的获得是利用了克隆技术中的
28、技术,使重组细胞的细胞核与牛的 融合。 (3)由图可知,动物克隆技术的基础是 。 A.动物细胞融合 B.动物细胞的全能性 C.动物细胞和组织培养 D.核移植 (4)利用转基因牛乳汁提取药物工艺简单,甚至可直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物(如牛)的膀胱上皮细胞中,利用转基因牛的尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性是: 、 。,-46-,教材梳理,题型探究,(5)重组细胞培养成早期胚胎利用了动物细胞培养技术。下列与动物细胞培养技术无密切关系的是 。 A.细胞全能性的揭示 B.噬菌体的研究 C.细胞周期调节控制机理的分析 D.对癌变机理和衰老原因的研究,答案:(1)基因工程 人的血清白
29、蛋白基因 (2)核移植 去核卵细胞 (3)C (4)处于不同发育时期的动物都可生产 雌性和雄性动物都可生产 (5)B,-47-,教材梳理,题型探究,解析:(1)基因工程可将目的基因人的血清白蛋白基因与受体细胞牛胚胎细胞的DNA进行重组。(2)克隆技术中的细胞核移植技术可将去核的牛卵细胞与含有目的基因的供体细胞核融合构建重组细胞。(4)建立膀胱生物反应器的好处是可以不分动物的性别及不同生长发育期,均可产生所需药物。(5)噬菌体是细菌病毒,无细胞结构,A、C、D项所述的内容都与细胞培养技术密不可分。,-48-,教材梳理,题型探究,易错提醒(1)动物难以克隆的根本原因:分化了的动物细胞的细胞质中的调节蛋白,关闭了细胞核中与个体发育有关的基因。 (2)重组卵发育成一个新个体,体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。 (3)重建合子的细胞质必须来自卵细胞的原因:卵细胞的细胞质中没有与关闭个体发育有关基因的调节蛋白。 (4)动物克隆属于无性繁殖,产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。 (5)通过动物体细胞核移植技术获得的克隆动物,其遗传物质和供核细胞的遗传物质不完全一样。细胞核遗传物质一样,但细胞质遗传物质和提供去核卵细胞的个体几乎完全一样(分析遗传物质来源时,一定要注意细胞核遗传物质和细胞质遗传物质的区别)。,
